VEGF基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞移植與單純間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死的療效對(duì)比

朱 磊 李鯤鵬 馬 捷

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院，太原 030001

VEGF基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞移植與單純間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死的療效對(duì)比

朱 磊 李鯤鵬 馬 捷

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院，太原 030001

目的 探討VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死的療效。 方法 將SD大鼠建立心肌缺血模型，1周后隨機(jī)取30只采用隨機(jī)分組法分為3組，A組為聯(lián)合移植組，B組為單純干細(xì)胞移植組，C組為對(duì)照組，通過(guò)一系列檢測(cè)，對(duì)比3組的療效。 結(jié)果 A組的療效優(yōu)于B組和C組，B組的療效優(yōu)于C組 （P＜0.05）。 結(jié)論 VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植比單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的綜合療效好。

心肌梗死；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染

臨床上心肌缺血多發(fā)生在40歲以后，但隨著人民生活水平的提高，目前心肌缺血在我國(guó)的患病率呈逐年上升趨勢(shì)。以往多采用傳統(tǒng)方法治療心肌缺血，如藥物治療、介入治療及外科手術(shù)治療（冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)）。近年來(lái)，隨著人們對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究的深入，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌缺血均有一定的療效，在治療心肌缺血方面已表現(xiàn)出傳統(tǒng)治療方法所無(wú)可比擬的優(yōu)越性[1]，但是這兩種方法究竟哪一種療效更好，少有報(bào)道。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞的一種，在適當(dāng)微環(huán)境和影響因子的作用下可以分化為多個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞，甚至可以重建簡(jiǎn)單的組織結(jié)構(gòu)，且其在體外的低免疫原性，為間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用提供了可能性[2-3]。VEGF是一種特異性促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有絲分裂原，是機(jī)體內(nèi)促進(jìn)血管生成最主要的生長(zhǎng)因子，功能是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，啟動(dòng)血管形成和增加血管通透性，能與內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，強(qiáng)烈地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、側(cè)支循環(huán)建立等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（Hyclone），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma），攜人VEGF腺病毒載體，0.25%胰蛋白酶 （華美公司），0.02%乙二胺四乙酸 （EDTA），ELISA試劑盒（博士德），jet-PEI細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（晶美），5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU，博士德）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 處死大鼠，無(wú)菌條件下獲取大鼠股骨和脛骨，使用DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將沖洗后的懸液直接接種在DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h和72 h各換液1次，去除非貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，以1∶3傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，到第3代時(shí)細(xì)胞可用于以后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 將攜人VEGF腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 將大鼠第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種至12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)上清。按jet-PEI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記 BrdU-可代替胸腺嘧啶在DNA合成的S期，活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，然后利用抗BrdU單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞[5]。將轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以3 μmol/L的BrdU培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即可等待移植。

1.2.4 大鼠急性心肌缺血模型的建立 選取40只健康成年SD大鼠，稱重后，使用3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射，并固定于手術(shù)板上，行氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。心前區(qū)備皮，常規(guī)消毒鋪單，在第3或第4肋間橫向切口開(kāi)胸，切開(kāi)心包。在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間冠狀動(dòng)脈處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。心電圖檢測(cè)ST段明顯抬高和（或）異常Q波出現(xiàn)表示建模成功。迅速縫合胸腔，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后，停止人工輔助呼吸。術(shù)后應(yīng)用青霉素3 d，400 000 U/d，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞移植和實(shí)驗(yàn)分組 40只用于制作模型的大鼠有8只在＜6 h死亡，在大鼠心肌缺血模型成功建立1周后，隨機(jī)選擇30只大鼠，采用隨機(jī)分組法分為3組，每組10只。A組為聯(lián)合移植組：將VEGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （1×106）與無(wú)血清DMEM配置成200 μl，將大鼠暴露心臟，使用微量注射器經(jīng)心外膜途徑在心肌梗死中央及外周移植細(xì)胞50 μl/點(diǎn)；B組為單純干細(xì)胞移植組：使用同等量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與DMEM制成細(xì)胞懸液，采用同等方法注入大鼠心??；C組為對(duì)照組：使用等量DMEM培養(yǎng)液，采用A組和B組的方法注入大鼠心肌。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 超聲心動(dòng)圖檢查 模型建立后，在細(xì)胞移植前和細(xì)胞移植后第3周分別采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)（EF），每只測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢查 細(xì)胞移植后第4周處死大鼠，制作心肌細(xì)胞連續(xù)切片，并進(jìn)行HE常規(guī)染色和BrdU染色，確定心肌細(xì)胞的存活與分化。

1.3.3 新生毛細(xì)血管密度計(jì)數(shù) 在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)毛細(xì)血管數(shù)量，每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野，取其平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠細(xì)胞移植前后EF的比較

細(xì)胞移植后3周，A組的EF高于B組和C組，B組的EF高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠細(xì)胞移植前后EF的比較（%，±s）

表1 3組大鼠細(xì)胞移植前后EF的比較（%，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

組別 n 細(xì)胞移植前 細(xì)胞移植后3周A組B組C組10 10 10 43±13 44±12 42±12 64±20 53±15*#37±16*

2.2 3組大鼠細(xì)胞移植后4周BrdU細(xì)胞個(gè)數(shù)的比較

細(xì)胞移植后4周，A組的BrdU細(xì)胞個(gè)數(shù)多于B組和C組，B組的BrdU細(xì)胞個(gè)數(shù)多于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。細(xì)胞移植后4周，A組和B組大鼠的梗死心肌均可以找到BrdU陽(yáng)性移植細(xì)胞，C組則無(wú)（圖1）。

表2 3組大鼠細(xì)胞移植后4周BrdU細(xì)胞個(gè)數(shù)的比較（個(gè)/高倍視野，±s）

表2 3組大鼠細(xì)胞移植后4周BrdU細(xì)胞個(gè)數(shù)的比較（個(gè)/高倍視野，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

組別 n 細(xì)胞移植后4周A組B組C組10 10 10 390±92 310±85*#0±0*

圖1 3組大鼠BrdU染色結(jié)果（×200）

2.3 3組大鼠細(xì)胞移植后4周新生血管計(jì)數(shù)的比較

細(xì)胞移植后4周，A組的新生血管計(jì)數(shù)多于B組和C組，B組的新生血管計(jì)數(shù)多于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。細(xì)胞移植后4周，3組心肌細(xì)胞梗死區(qū)域均可見(jiàn)新生毛細(xì)血管影（圖2）。

表3 3組大鼠細(xì)胞移植后4周新生血管計(jì)數(shù)的比較（個(gè)/高倍視野，±s）

表3 3組大鼠細(xì)胞移植后4周新生血管計(jì)數(shù)的比較（個(gè)/高倍視野，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

組別 n 細(xì)胞移植后4周A組B組C組10 10 10 34±12 28±11*#19±8*

圖1 3組大鼠HE染色結(jié)果（×200）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植比單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的效果更明顯，說(shuō)明VEGF與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有協(xié)同治療心肌梗死的作用，原因可能是VEGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后移植到梗死區(qū)域，使新生血管數(shù)目增加更多；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能向內(nèi)皮細(xì)胞分化，參與移植后血管生成，并分泌VEGF[6-7]。心肌干細(xì)胞移植及聯(lián)合移植是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，移植細(xì)胞的活力受到心肌梗死多種不利因素的影響，包括：凋亡、缺少營(yíng)養(yǎng)、缺血、宿主的相關(guān)因子、炎癥和免疫應(yīng)答等[8]。目前仍有許多問(wèn)題尚待解決，如選擇對(duì)人體無(wú)損害又便于追蹤的標(biāo)志物；移植的最佳途徑、最佳時(shí)機(jī)、細(xì)胞數(shù)量尚不明確 （劑量過(guò)大可產(chǎn)生較多不良反應(yīng)）[9]；細(xì)胞移植后能否在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活并正常增殖、分化等。同時(shí)基因修飾干細(xì)胞的移植過(guò)程很復(fù)雜，在將來(lái)工作中開(kāi)展一種簡(jiǎn)單的過(guò)程替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、轉(zhuǎn)染和外科注射的常規(guī)操作很有必要。

綜上所述，VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植比單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死的綜合療效好。

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Curative effect comparison of mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection and simple mesenchymal stem cell transplantation in rat with myocardial infarction

ZHU LeiLI Kun-peng MA Jie
The Second Clinical Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo investigate the curative effect comparison of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection and simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat with myocardial infarction.MethodsThe myocardial ischemia model of SD rat was established,after 1 week and 30 rats were randomly selected and divided into 3 groups,group A was transplantation group,group B was simple stem cell transplantation group,group C was control group.Through a series of tests,curative effect of three groups was compared.ResultsCurative effect in Group A was better than that in group B and group C respectively,curative effect in group B was better than that in group C(P＜0.05).ConclusionThe comprehensive curative effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection is better than that of simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.

Myocardial infarction;Vascular endothelial growth factor;Bone marrow mesenchymal stem cells;Gene transfection

R542.2+2

A

1674-4721（2014）03（c）-0009-03

2014-01-20本文編輯：李亞聰）