1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠腎小管間質膠原蛋白Ⅲ表達的影響

林建明 周 潔 楊 霞 達靜靜 何平紅 易 韋 查 艷▲

1.貴州省人民醫院腎內科，貴陽 550002；2.貴州省興義市人民醫院腎內科，貴州興義 562400；3.貴州省人民醫院病理科，貴陽 550002

1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠腎小管間質膠原蛋白Ⅲ表達的影響

林建明1★周 潔2★楊 霞1達靜靜1何平紅1易 韋3查 艷1▲

1.貴州省人民醫院腎內科，貴陽 550002；2.貴州省興義市人民醫院腎內科，貴州興義 562400；3.貴州省人民醫院病理科，貴陽 550002

目的 探討1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠腎小管間質膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達的影響。 方法 將實驗動物按隨機數字表法分為3組（n=7）：假手術組（對照組）、進展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d）1，25-（OH）2-D3干預組（治療組）。除對照組外，其余組均采用右腎切除并2次注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體，制備進展性腎炎大鼠模型。1，25-（OH）2-D3干預8周后，檢測各組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及電解質的變化，Masson染色觀察腎組織病理改變。免疫組織化學檢測腎小管間質ColⅢ的表達。 結果 與模型組比較，1，25-（OH）2-D3治療不僅使大鼠24 h尿蛋白及BUN均明顯降低（P＜0.05），還能使ColⅢ表達顯著下調（P＜0.05）。腎組織病理損害明顯減輕。 結論 1，25-（OH）2-D3可能通過明顯降低進展性腎炎大鼠腎小管間質ColⅢ的表達，減輕腎小管間質纖維化而發揮腎臟保護作用。

1，25-（OH）2-D3；ColⅢ；進展性腎炎；腎小管間質纖維化；大鼠

腎小管間質的細胞外基質過度沉積容易引起腎功能不全，常見于許多慢性腎臟疾病。間質膠原，尤其是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，通常作為腎組織基底膜的“腳手架”而普遍存在于腎臟中[1-2]。膠原及其相關分子在腎小管間質的積聚即可以定義為腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。腎小管間質纖維化的病變程度嚴重影響了腎功能的正常運作。延緩或阻止腎小管間質纖維化的進展，可以預防慢性腎臟病的發生[3]。1，25-（OH）2-D3除調節鈣磷代謝外，在調節各種生物過程（如免疫調節、細胞增殖和分化、抗纖維化、減少尿蛋白）中發揮至關重要的作用[4]。但是，1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎腎小管間質纖維化的保護作用尚不完全清楚。本研究旨在探討1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠模型中RIF膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達的影響，并觀察腎臟組織病理形態學的改變，便于進一步了解1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠RIF的可能作用途徑及影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1，25 -（OH）2-D3購自美國Sigma公司，IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體購于美國Neo Markers公司，大鼠ColⅢ免疫組織化學試劑盒購于武漢BOSTER生物工程有限公司。

1.2 儀器

全自動多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動物模型制備及分組

雄性SD大鼠（重慶騰鑫生物技術公司提供，二級）21只，體重（131.2±10.0）g。將21只大鼠按隨機數字表法分為3組（n=7）：假手術組（對照組，只做腎包膜剝離，不予腎臟切除）、進展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d）1，25-（OH）2-D3干預組 （治療組），選用進展性腎炎模型參照參考文獻[4]，行右腎摘除術，分別于術后第1、2周予尾靜脈注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體1.2 mg/（kg·d），共2次。1，25-（OH）2-D3干預組于術后予1，25-（OH）2-D36 ng/（100 g·d）入飲水中灌胃至8周。所有大鼠均于8周后處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標本。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 處死大鼠前3 d，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，每只收集3次，用雙縮脲法測定尿蛋白含量，求平均尿蛋白含量。

1.4.2 血生化檢測 取大鼠心臟血清，測定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、鈣、磷等。

1.4.3 腎臟組織病理學檢查 腎組織以10%甲醛固定并編號，石蠟包被，2 μm厚連續切片，Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。細胞核染黑藍色，膠原纖維呈綠色，肌纖維、紅細胞呈紅色。

1.4.4 免疫組織化學法檢測 ColⅢ蛋白的表達：取2 μm厚石蠟切片，常規脫蠟至水，滅活內原性酶，熱修復抗原，抗原抗體反應，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。操作步驟按試劑盒說明書進行。陽性產物呈深褐色，不加抗體為陰性對照。

1.4.5 免疫組織化學分析 采用顯微圖像分析系統（Olympus C3040-ADU）對各組染色結果進行積分光密度值（integral optical density，IOD）測定，每張切片隨機選取10個高倍視野，每個視野代表0.13 mm2的區域面積，計算其IOD值，取平均值。

1.5 統計學方法

所得數據采用SPSS 18.0統計軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，經方差齊性檢驗，再進行兩獨立樣本均數t檢驗和組內的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠24 h尿蛋白、腎功能的影響

術后8周，模型組24 h尿蛋白量、SCr和BUN均顯著高于對照組（P<0.05）。經1，25-（OH）2-D3干預治療后，與模型組比較，24 h尿蛋白量、BUN均顯著降低（P<0.05），兩組間SCr差異無統計學意義（P>0.05）。治療前后電解質鈣、磷水平在治療組無明顯變化（P> 0.05）（表1）。

表1 3組大鼠各項檢測指標的比較（±s）

表1 3組大鼠各項檢測指標的比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 尿蛋白（m g / 2 4 h ）S C r （μ m o l / L ）B U N （m m o l / L）鈣磷（m m o l / L）（m m o l / L）對照組模型組治療組2 0 . 4 8 ± 5 . 6 8 2 8 5 . 7 3 ± 2 8 . 3 3*1 3 9 . 5 7 ± 1 7 . 4 9#4 5 . 9 2 ± 5 . 3 8 1 6 9 . 2 7 ± 1 5 . 5 8*1 3 3 . 4 1 ± 9 . 8 9 9 . 5 8 ± 3 . 7 2 1 6 . 9 2 ± 5 . 0 1*1 2 . 9 7 ± 4 . 2 8#1 . 8 7 ± 0 . 0 6 1 . 9 0 ± 0 . 0 4 1 . 8 8 ± 0 . 0 5 1 . 6 6 ± 0 . 0 7 1 . 6 8 ± 0 . 0 6 1 . 6 4 ± 0 . 0 8

2.2 1，25-（OH）2-D3對腎組織病理變化的影響

Masson染色（圖1）顯示，對照組腎小管間質形態基本正常；模型組見腎小管上皮細胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴張、間質膠原纖維增厚。與對照組比較，模型組間質炎癥和纖維化進行性加重。與模型組比較，治療組腎小管上皮細胞形態恢復正常，間質炎癥得到改善，膠原纖維積聚減少。

圖1 各組大鼠腎間質的組織病理學改變（×200，Masson染色）

2.3 1，25-（OH）2-D3對進展性腎炎大鼠腎間質ColⅢ蛋白表達的影響

ColⅢ蛋白表達主要集中于腎小管上皮細胞和間質細胞的胞質，模型組腎間質ColⅢ蛋白表達較對照組顯著增多（P<0.01），應用1，25-（OH）2-D3治療后，ColⅢ表達均較模型組明顯減少（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腎間質ColⅢ蛋白的變化（×200，免疫組織化學）

3 討論

腎臟纖維化是一個常見的導致腎臟功能衰竭的終末事件。因此，了解腎臟纖維化的發生、發展過程對腎臟疾病的早期干預治療有重大意義。近年來研究證實，一種活性維生素D3類似物——帕立骨化三醇可以減緩單側輸尿管結扎大鼠模型中間質纖維化、抑制腎小管上皮-間充質轉化（EMT）[5]、改善腎臟炎癥[6-7]，減少尿蛋白，抑制足細胞損傷[8]。因而，本研究觀察了進展性腎炎1，25-（OH）2-D3通過抑制RIF ColⅢ的表達，發揮進展性腎炎抗纖維化的保護作用。

本研究中，Masson染色結果顯示，模型組腎小管上皮細胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴張、間質膠原纖維增厚，與對照組比較，模型組間質炎癥和纖維化進行性加重，證實系膜增生性腎炎模型大鼠是目前觀察進展性腎炎比較理想的動物模型[9-10]。生化指標顯示，模型組24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均較對照組明顯升高，表明進展性腎炎的大鼠模型造模成功。在予以1，25-（OH）2-D3干預治療后發現，與模型組相比，24 h尿蛋白含量及BUN均降低，提示1，25-（OH）2-D3可以減少進展性腎炎大鼠模型中的尿蛋白含量、抑制腎臟纖維化，提高腎臟功能。另外，本實驗還監測了血電解質鈣、磷的變化，發現在給予1，25-（OH）2-D3治療前后，鈣、磷無明顯統計學差異，表明該1，25-（OH）2-D3的實驗濃度[11]不會引起鈣、磷代謝紊亂，從而干擾實驗結果的準確性。

ColⅢ是腎組織基底膜的重要組成成分，對維持基底膜的完整性發揮重要作用[12]。ColⅢ表達的過多或過少均提示腎組織基底膜的結構及完整性發生了改變。在腎組織基底膜中，腎間質基底膜占其總量的85%～90%[13]。本研究中亦發現進展性腎炎大鼠模型腎間質組織中ColⅢ表達較對照組明顯增加，而應用1，25-（OH）2-D3干預后，ColⅢ表達明顯下降，進一步提示了1，25-（OH）2-D3可能通過ColⅢ表達減少，減輕RIF的發生、發展。本課題組前期實驗發現，進展性腎炎大鼠模型腎間質組織中結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達增加，該因子又是公認的較強的促纖維化生長因子[14]，可促進細胞分泌細胞外基質，如ColⅢ[15]、纖連蛋白和整合素α5顯著增加[16]，提示1，25-（OH）2-D3降低ColⅢ的表達可能通過抑制腎小管間質組織中CTGF的表達發揮作用。

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The effects of 1,25-(OH)2-D3on the expression in tubulointerstitial of ColⅢin rat with progressive nephritis

LIN Jian-ming1★ZHOU Jie2★YANG Xia1DA Jing-jing1HE Ping-hong1YI Wei3ZHA Yan1▲
1.Department of Nephrology,Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China;2.People′s Hospital of Xingyi City in Guizhou Province,Xingyi 562400,China;3.Department of Pathology,Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-(OH)2-D3on the expression in tubulointerstitial of ColⅢin rat with progressive nephritis.MethodsExperimental rats were divided into three groups according to random number table method:sham operation group(control group),progressive nephritis group(model group),and progressive nephritis group treated with 6 ng/(100 g·d)1,25-(OH)2-D3(treatment group).In addition to the control group,the other progressive nephritis model was established by right nephrectomy and injection with IgG(OX-7)mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody twice.Progressive nephritis rats received 1,25-(OH)2-D3by intragastric administration for 8 weeks,the urine protein of 24 hours,serum creatinine(SCr),blood urea nitrogen(BUN）and the levels of calcium and phosphorus in rats of each group were measured.The renal morphologic changes were evaluated on Masson stained sections.The expression in tubulointerstitial of ColⅢ was detected by immunohistochemical.ResultsThe 24 hours urine protein and BUN in tubulointerstitial were lower in 1,25-(OH)2-D3treatment group than those in model group(P<0.05).In addition,the expressions of ColⅢmRNA in 1,25-(OH)2-D3treatment group were significantly lower than those in model group(P<0.05). The renal pathological damage was significantly reduce.Conclusion1,25-(OH)2-D3may protect kidney by decreasing the expression of tubulointerstitial fibrosis gene ColⅢin the progressive nephritis model rats,and reduce renal tubular interstitial fibrosis and renal protective effect into full play.

1,25-(OH)2-D3;ColⅢ;Progressive nephritis;Tubulointerstitial fibrosis;Rats

R692.3

A

1674-4721（2014）02（a）-0004-04

2013-11-01本文編輯：林利利）

國家自然科學基金（81200539）；2012年貴州省省長基金（黔省專合字（2012）128號）；2010年貴州省優秀科技教育人才省長專項資金項目（黔省專合字（2010）89號）；貴州省國際科技合作計劃項目（黔科合外G字[2012]7045號）

林建明（1958-），男，副主任醫師，研究方向：腎小球和腎小管間質疾病；周潔（1975-），男，主治醫師，研究方向：原發性腎小球疾病

▲通訊作者

★并列第一作者