腸源性高草酸尿大鼠模型的建立

陳清江，李 遜，雷 鳴，何永忠

(1.廣州醫科大學附屬第五醫院泌尿外科，廣東 廣州 510700；2.廣州醫科大學附屬第一醫院海印微創外科中心，廣東 廣州 510120)

腸源性高草酸尿大鼠模型的建立

陳清江1，李 遜1，雷 鳴2，何永忠1

(1.廣州醫科大學附屬第五醫院泌尿外科，廣東 廣州 510700；2.廣州醫科大學附屬第一醫院海印微創外科中心，廣東 廣州 510120)

目的建立腸源性高草酸尿的大鼠模型。方法隨機選取30只雌性SD大鼠置于大鼠代謝籠中適應性喂養7 d之后收集24 h尿，記錄尿量，采用離子色譜儀測定其草酸濃度，計算正常大鼠在該條件下24 h尿草酸排泄量。菠菜汁灌胃處理大鼠，再測定灌胃后24 h尿草酸排泄量。對比灌胃菠菜汁前后，大鼠24 h尿草酸排泄量的差別；分組對照實驗，隨機選取20只雌性SD大鼠，隨機分成A組和B組，B組灌胃菠菜汁，A組灌胃等量純凈水，其他條件相同，比較兩組24 h尿草酸排泄量。結果反復測定，正常大鼠灌胃菠菜汁前24 h尿草酸排泄量為(0.53±0.18)mg，灌胃菠菜汁后第1天為(1.93±0.36)mg，第3天為(1.85±0.38)mg，第7天為(2.03±0.39)mg；A組(0.44±0.12)mg，B組(1.68±0.38)mg。結論大鼠在灌胃菠菜汁之后其尿液24 h草酸排泄量明顯增加，大概增加3～4倍，說明每天對大鼠進行定量定濃度的菠菜汁灌胃，可以使其保持長期的高草酸尿狀態，該方法建立的腸源性高草酸尿大鼠模型簡便可行，可廣泛用于其他方面的研究。

腸源性高草酸尿；尿；大鼠模型；離子相色譜

我國泌尿系結石的人群患病率為2%～5%[1]。泌尿系結石是泌尿外科的常見病多發病，因此，如何預防泌尿系結石已日益成為人們關心的問題。我國是世界上泌尿系結石三大高發區之一，大部分尿路結石為草酸鈣結石，而高草酸尿是其重要的成石因素。本實驗擬從大鼠日常飲食中添加外源性高草酸食物(菠菜)，構建腸源性高草酸尿癥的動物模型，旨在探討通過飲食控制能否控制尿液草酸濃度，降低尿路結石成石因素，從而起到預防尿路結石的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 菠菜購自超市，自然完整狀態下洗凈晾干，用水果榨汁機榨成菠菜汁，密封保存于4℃。

1.2 儀器和試劑 實驗儀器：離子色譜儀792 Basic IC(瑞士萬通公司)，其操作方式通過792 BasicIC 1.0軟件控制和估算。大鼠代謝籠(廣州飛迪科技有限公司)。試劑配制：淋洗液：分別稱取5.007 4 g的Na2CO3和0.294 0 g的NaHCO3加去離子水至2 L，配制成濃度為17.5 mmol/L的Na2CO3和3.5 mmol/L的NaHCO3；再生液：4 ml濃H2SO4加去離子水配制成濃度為50 mmol/L。取二水草酸(C2H2O4·2H2O)0.143 2 g加去離子水100 ml配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液，可4℃保存1周，再配制100 mg/L的工作液。

1.3 實驗動物 50只SD大鼠(雌性，SPF級)，體重在200～220 g，購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002]。

1.4 實驗方法

1.4.1 自身灌胃前后對照 隨機選取30只SD大鼠置于大鼠代謝籠中，標準顆粒飼料喂養，自由飲用自來水，適應性喂養7 d之后收集第1天的24 h尿，記錄尿量，取0.1 ml尿液，用去離子水滴定至5 ml，再通過0.2 μm的微孔濾膜過濾后注入離子色譜儀，檢測尿中草酸濃度，計算大鼠24 h尿草酸排泄量；同法計算第3 d大鼠24 h尿草酸排泄量，統計出正常大鼠24 h尿草酸排泄量；實驗過程中若有大鼠日飲水量低于10 ml，收集尿液低于4 ml，則將其從實驗中剔除。

1.4.2 菠菜汁灌胃前后對照 市場購入新鮮菠菜，洗凈晾干，采用水果榨汁機將其榨成菠菜汁，取菠菜汁0.1 ml加入去離子水稀釋至5 ml，通過0.2 μm的微孔濾膜后注入離子色譜儀，計算菠菜汁濃度，大概5～6 mg/ml，以100 mg/(kg·d)的菠菜汁草酸濃度對實驗大鼠進行灌胃處理。分別于灌胃第1、3、7天收集大鼠24 h尿，同法檢測24 h尿液草酸排泄量。與灌胃前的24 h尿草酸排泄量形成比較。

1.4.3 隨機分組對照 隨機選取20只SD大鼠，隨機分為A組和B組，每組10只，B組按之前的方法灌胃菠菜汁，A組灌胃等量的純凈水，置于代謝籠中收集24 h尿液，計算尿量，離子色譜儀檢測尿液草酸濃度，其他實驗條件一致。每次收集24 h尿的前一天記錄大鼠的體重(g)。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0進行統計學分析，數據采用均數±標準差()表示。組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 草酸標準曲線的繪制 取100 mg/L的工作液，用去離子水稀釋至1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，分別注入離子色譜儀進樣孔，在6.18 min出現草酸峰，經過792 Basic IC 1.0軟件進行數據處理，自行繪制標準曲線。草酸在1～20 mg/L范圍內，線性關系良好，RSD=1.106%，曲線相關系數r=0.999 91，偏移值(截距)為0.685 33，斜率為2.711 43，回歸直線方程Y=2.711 43X+0.685 33，靈敏度達0.04 mg/ml，同時取工作液，分別稀釋至0.25 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L，發現其在0～1 mg/L范圍內也有良好的線性關系。草酸回收實驗結果見表1。

表1 草酸回收實驗結果

2.2 大鼠體重 實驗各組大鼠的體重均逐漸增加，灌胃前與灌胃后1 d分組對照實驗組間差異無統計學意義(P＞0.05)

2.3 大鼠24 h尿量 無論是自身對照還是分組對照實驗，各組間差異無統計學意義(P＞0.05)

2.4 24 h尿草酸排泄量 灌胃后各組與灌胃前比較，24 h尿草酸排泄量明顯增加，但灌胃后三組之間差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2、表3。

注：與灌胃前比較，aP＜0.05。

表3 分組對照實驗24 h尿草酸排泄量的比較()

表3 分組對照實驗24 h尿草酸排泄量的比較()

注：B組與A組比較，P＜0.05，大概升高3～4倍。

組別A組(n=10) B組(n=10)尿草酸排泄量(mg/24 h，) 0.44±0.12 1.68±0.38

3 討 論

在臨床上，尿路結石成分分析顯示出82%左右是草酸鈣結石[2]，在草酸鈣結石的成石因素中，尿液中高草酸這一因素占據著主導地位，腎小管上皮細胞損傷是結石形成的必備條件，而尿液高草酸濃度能對腎小管上皮細胞產生細胞毒作用，通過抗氧化自由基作用而損傷腎小管上皮細胞，促進結晶的粘附[3-4]。高草酸尿癥在臨床上分為：特發性高草酸尿、腸源性高草酸尿和原發性高草酸尿。原發性高草酸尿是由于肝臟缺乏AGT和DGDH或者功能異常導致的，特發性高草酸尿表現出一定的家族遺傳性，可由具有明顯高草酸尿癥的近交系大鼠傳代培養獲得[5]，而腸源性高草酸尿癥則有慢性腸病、短腸綜合征等病因誘發，想要獲取其動物模型較難。本實驗基于在飲食中添加外源性草酸，使其腸內游離草酸增多，進而增加了外源性草酸的吸收，最終增加了尿草酸的排泄量[6-7]，從而獲得高草酸尿癥的動物模型。本文重點在于研究泌尿系結石的成石因素，研究表明，高草酸尿是草酸鈣結石最危險的成石因素，高草酸尿對草酸鈣過飽和的影響是其他影響因素的10倍[8]；本實驗選取菠菜作為外源性高草酸的飲食來源，因其作為人們喜愛的蔬菜，一直以營養價值高而備受歡迎，此外其獲取途徑簡便快捷、經濟易操作，同時菠菜是一種大家熟悉的富含草酸的食物，高草酸對于人體來說是一種抗營養因子，長期食用可增加尿液草酸排泄量，引起泌尿系結石[9-11]，是否增加飲食中草酸的含量，就會增加尿液草酸的排泄量？是否穩定？這些就是本實驗所要解決的問題。

實驗中采取飲食中添加菠菜的方法，來達到高草酸尿癥的效果。菠菜取材簡便，草酸含量高，是人們日常飲食中較為常見的蔬菜，也廣為大眾喜愛，以該方法構建高草酸尿癥的動物模型，是本實驗的創新點之一。由于以前缺乏精確檢測草酸的方法和儀器，難以對尿液草酸，食物中草酸的含量進行檢測，也就難以從這些方面構建高草酸尿癥的動物模型。然而本實驗采用離子色譜法[12]檢測草酸含量，可以解決這個問題，其精度可以達到0.5 μm/L，操作過程簡便，快捷，樣本處理簡單，適用于大規模檢測草酸，能滿足該實驗大規模篩選測定草酸含量的需要，是一種先進的檢測技術。該方法具有方便快捷、操作簡便、所需尿量少、結果準確等優點。而本實驗中的標準曲線、重復性實驗、回收率實驗等也證實了這一點。傳統的變色酸比色法檢測尿液草酸需要水浴濃硫酸，對工作人員和環境有影響，且實驗時間長，草酸需要1～2 d，難以滿足大規模樣本的測定，而本實驗的離子色譜法，測定一個樣本的時間只需要6～8 min。

先進的大鼠代謝籠，其設計特點使得大鼠的尿液和糞便得以分離，在經過實驗方法改良之后，能完全將尿液和糞便隔離，從而保證能夠準確的收集到大鼠24 h尿液且無糞便污染，這些設計得以保證大鼠24 h尿液草酸排泄量測定的可靠性。

大鼠飲食中，對標準顆粒飼料所含的草酸進行檢測，使得顆粒飼料中的草酸含量穩定，從而保證其測定結果具有可比性。控制單一變量，添加菠菜汁與否。在以上的條件下進行試驗，其結果不添加菠菜飲食的大鼠24 h尿草酸為(0.53±0.18)mg，添加菠菜飲食的大鼠24 h尿草酸為(1.85±0.38)mg。飲食中添加菠菜的大鼠中尿草酸比不添加菠菜的大鼠要高出3～4倍，且進行持續性的灌胃菠菜汁處理，觀察7 d、1個月，其尿液草酸含量基本穩定在一個較高的范圍內(1.35～2.68)mg/24 h。如果停止灌胃菠菜汁，一般于第三天其尿草酸可以降到正常范圍。提示該腸源性高草酸尿的大鼠模型需要持續性給予高草酸飲食才能達到維持建模效果。由于菠菜汁獲取途徑簡便，灌胃操作簡單，本腸源性高草酸尿的大鼠模型的構建還是很成功的，可以廣泛用于其他方面的研究，提供動物模型。本動物模型的構建成功，也為后續比較乳雙歧桿菌和產甲酸草酸桿菌降低尿草酸能力的比較提供可靠的動物模型。

本實驗成功構建了大鼠的腸源性高草酸尿癥動物模型，驗證了飲食中如果長期高草酸飲食可以引起尿草酸增加的現象，從而指導日常飲食，但長期的尿液高草酸狀態是否就會引起泌尿系結石仍值得進一步探討。

綜上所述，通過控制大鼠外源性草酸的攝入量，可以在大鼠體內成功建立“腸源性高草酸尿癥”動物模型。結合該實驗模型，針對我國素食習慣為主人群，對于預防草酸鈣結石和防止結石復發起著重要的指導作用。

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Establishment of rats model with enterogenous hyperoxaluria.

CHEN Qing-jiang1,LI Xun1,LEI Ming2,HE Yong-zhong1.
1.Department of Urology Surgery,the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University, Guangzhou 510700,Ghuangdong,CHINA;2.Haiyin Minimally Invasive Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University,Guangzhou 510120,Ghuangdong,CHINA

ObjectiveTo establish enterogenous hyperoxaluria model in rats.MethodsThirty randomly selected female Sprague-Daw-ley rats were fed in individual metabolic cage for 7 days.24 h urine oxalate excretions were examined by ion chromotagraphy before and after the spinach juice lavage,and the difference was investigated. Another 20 female Sprague-Daw-ley rats were randomly divided into group A and group B.Group B was lavaged with spinach juice and group A was lavaged with equivalent pure water.24 h urine oxalate excretions of group A and group B were compared.ResultsThe 24 h urine oxalate excretion was(0.53±0.18)mg before lavaging spinach juice.On first day,third day and seventh day after lavaging spinach juice,the 24 h urine oxalate excretions were(1.93±0.36)mg, (1.85±0.38)mg,and(2.03±0.39)mg，respectively.The 24 h urine oxalate excretion of group A and group B were (0.44±0.12)mg and(1.68±0.38)mg,respectively.Conclusion The 24 h urine oxalate excretion of SD rats was markedly increased 3 to 4 times after lavaged with spinach juice.Daily lavage with quantitatively and constant concentration spinach juice can maintain long-term high oxalic acid urine state in rats.This method of establishing enterogenous hyperoxaluria model in rats is simple and feasible,which can be widely used.

Enterogenous hyperoxaluria;Urine;Rats model;Ion chromotagraphy

R-332

A

1003—6350（2014）14—2036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.14.0792

2014-01-20)