LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)

陳峰，李海龍，賴偉勇，譚銀豐

(1.海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南海口 571101；2.海南醫學院藥學院，海南海口 571101)

LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)

陳峰1，2，李海龍1，2，賴偉勇1，2，譚銀豐1，2

(1.海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南海口 571101；2.海南醫學院藥學院，海南海口 571101)

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊后，益智黃酮(楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)二相結合產物的酶水解。方法雄性Sprague-Dawley大鼠膽管插管手術完畢后經灌胃給予縮泉膠囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h膽汁。膽汁樣品經β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)處理后，利用液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS/MS)進行分析。結果益智黃酮的葡萄糖醛酸結合物在酶水解處理后，代謝物的色譜峰消失，釋放出黃酮的原形物質形式。雖然脫甲基反應后形成葡萄糖醛酸結合物也被水解，但并未能檢測到脫甲基產物。結論β-葡萄糖醛酸水解酶處理可進一步確定益智黃酮在大鼠膽汁中的物質形式，也為定量分析奠定基礎。

縮泉膠囊；益智；黃酮；酶水解；液相色譜-質譜聯用儀

尿失禁主訴為尿液不自主的流出，是一種常見的、令人苦惱的疾病，給患者的生活質量帶來不利影響[1]。尿失禁有多種致病因素，如膀胱功能障礙(過度活動或活動低下)、物理性的梗阻、感染或者藥物的副作用(如咖啡因)。某些較為嚴重的疾病如癌癥、糖尿病、中風、帕金森氏疾病、多發性硬皮病等也可引起尿失禁。根據全國六大區的流行病學調查結果推斷，中國女性尿失禁患者平均發病率為30.9%，且年齡越大發病率越高。目前，人們對尿失禁的報道、診斷和治療顯著不足，對尿失禁的重視程度遠遠不夠。我國已經進入老齡化社會，老年人口所占比例日趨增加，尿失禁問題將對個人、家庭及社會帶來巨大困擾。

尿失禁的藥物治療越來越受到重視，化學藥物(如托特羅定、達非那新和奧昔布寧等)在整個藥物治療市場份額中占據主導地位，而縮泉丸及改進制劑縮泉膠囊是為數不多的治療尿失禁的中藥品種。縮泉丸源于宋代的《魏氏家藏方》[2]，由益智仁、烏藥和山藥三味中藥組成，用于治療多尿、尿頻、遺尿，被2010版《中國藥典》一部收載[3]。縮泉丸在國內9家企業生產(其中8個為水丸，1個為膠囊)，其中縮泉膠囊在2012年的銷售額達到5 000萬元。縮泉丸多成分體內過程研究較為薄弱，機體如何處置縮泉丸中的化學物質尚待闡明。我們分析了縮泉丸中主要成分的含量[4]，并對大鼠灌胃縮泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系統中的暴露進行了初步研究[5]。縮泉丸中黃酮類物質的膽汁排泄研究有助于我們了解這些物質的轉運過程，作為這項研究的第一部分，本課題組已經測定了大鼠膽汁中的二相結合產物，本文主要探討這些二相代謝產物的酶水解。

1 材料與方法

1.1 試藥β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，來自海曼蝸牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)購自Sigma公司。其他同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)[6]。

1.2 實驗動物、給藥及樣品采集同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

1.3 膽汁樣品的酶水解[7]取100 μl膽汁樣品，加入200 μl β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)，再加入50 μl抗壞血酸(5 mg/ml)，輕輕振搖后，在水浴上37°C孵育60 min。孵育結束后，加入1000 μl乙酸乙酯放在漩渦振蕩器上震蕩5 min，結束后將樣品至于離心機中，離心10 min，吸取上清液900 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩渦振蕩器上震蕩5 min，再離心10 min，吸取40 μl樣品溶液置于樣品瓶的內襯管中，進樣量為10 μl。

1.4 LC-MS/MS分析方法色譜條件和質譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

2 結果

2.1 白楊素二相代謝產物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后白楊素及其可能的代謝產物見圖1。經水解后，大鼠膽汁中處于結合狀態的白楊素被釋放出來(保留時間為5.94 min)，原來膽汁中的白楊素單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.14 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時間為3.11 min)的色譜峰消失。

圖1 大鼠膽汁中白楊素二相代謝產物的水解

2.2 楊芽黃素二相代謝產物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后楊芽黃素及其可能的代謝產物見圖2。膽汁中楊芽黃素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.84 min)的色譜峰消失，釋放出楊芽黃素的原形產物(保留時間為7.06 min)。保留時間為5.23 min的色譜峰結構需要進一步的研究。

圖2 大鼠膽汁中楊芽黃素二相代謝產物的水解

2.3 伊砂黃素二相代謝產物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后伊砂黃素及其可能的代謝產物見圖3和圖4。膽汁樣品經甲醇沉淀后未出現伊砂黃素原形物質形式，但酶水解后伊砂黃素從結合物中被釋放出來(保留時間為7.30 min)。保留時間為4.28 min的伊砂黃素單葡萄糖醛酸化代謝物以及保留時間為3.79 min雙葡萄醛酸代謝物的色譜峰消失，但5.29 min的色譜峰在酶水解時未完全消失。由圖4可知，保留時間為4.62 min和4.84 min的單葡萄糖醛酸結合物以及保留時間為3.16 min雙葡萄糖醛酸結合產物的色譜峰在酶水解處理后均消失，但并未檢測到伊砂黃素的脫甲基化產物。

圖3 大鼠膽汁中伊砂黃素二相代謝產物的水解

圖4 大鼠膽汁中伊砂黃素脫甲基后的二相代謝產物的水解

2.4 芹菜素-4'，7-二甲氧醚二相代謝產物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后芹菜素-4'，7-二甲氧醚及其可能的代謝產物見圖5。經酶水解后，膽汁中的硫酸酯化的代謝物(保留時間為3.29 min)和芹菜素-4'，7-二甲氧醚的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為5.11 min)均消失，此時的膽汁樣品可以檢測到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的原形物質形式(保留時間為7.22 min)。由圖6可知，在膽汁樣品中未發現芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產物，芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后所形成的二相結合產物，包括單葡萄糖醛酸結合物(保留時間為4.28 min)和雙葡萄糖醛酸結合產物(保留時間為3.25 min和3.79 min)在酶水解處理后均消失。保留時間為5.29 min單葡萄糖醛酸結合物在該樣品中依然可以檢測到。但是，水解后的樣品中未檢測到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產物。

圖6 大鼠膽汁中芹菜素-4’,7-二甲氧醚脫甲基后二相代謝產物的水解

2.5 山奈素二相代謝產物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后山奈素及其可能的代謝產物見圖7。膽汁樣品經酶水解處理后，山奈素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.80 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時間為3.16 min)的色譜峰均消失，在膽汁中發現山奈素的原形物質形式(保留時間為6.15 min)，但濃度較低。保留時間為6.05 min的色譜峰結構需要進一步的研究。

圖7 大鼠膽汁中山奈素二相代謝產物的水解

3 討論

二相代謝產物(如葡萄糖醛酸結合物、硫酸酯結合物等)的水解可采用酸水解或酶水解的方法進行。酸水解時，將樣品和酸溶液在一定的溫度下反應一定時間，導致酯鍵斷裂。酸水解受酸的種類、濃度、水解溫度和水解時間的影響。酶水解相對比較溫和，但比較高效，實驗費用也比較高。酶的來源、酶濃度、水解溫度和時間的也影響水解效果[8]。總的來說，藥物二相代謝產物的水解首選酶水解的方法。因此本文采用酶水解的方法，研究益智黃酮二相代謝產物的水解。

白楊素、楊芽黃素、伊砂黃素、芹菜素-4'，7-二甲氧醚和山奈素的葡萄糖醛酸結合物在酶水解后釋放出相應的苷元。因為伊砂黃素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚去單甲基后的單葡萄糖醛酸結合物有不同的結合位置，各有兩個色譜峰，水解后其中一個(保留時間為4.28 min)消失，另一色譜峰(保留時間為5.29 min)依然可測。另外，伊砂黃素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后形成的二相代謝產物在酶處理后也消失，但相應的脫甲基后的黃酮苷元卻檢測不到。這些現象值得深入研究。

綜上所述，我們通過研究發現膽汁中益智黃酮葡萄糖醛酸結合物被β-葡萄糖醛酸水解酶水解，釋放出相應的苷元，進一步確定了益智黃酮在大鼠膽汁中的物質形式，也為這些黃酮苷元的定量分析奠定基礎。

[1]Robinson D,Cardozo L.New drug treatments for urinary incontinence[J].Maturitas,2010,65(4):340-347.

[2]孫世發.縮泉丸方來源淺析[J].中醫雜志,1994,35(7):439.

[3]國家藥典委員會.《中國藥典》2010版.一部.中國醫藥科技出版社,2010:1218.

[4]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[5]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[6]Qing ZJ,Yong W,Hui LY,et al.Two new natural products from the fruits of Alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideactivated RAW264.7 macrophage cells[J].Arch Pharm Res,2012,35(12):2143-2146.

[7]Shia CS,Hou YC,Tsai SY,et al.Differences in pharmacokinetics and ex vivo antioxidant activity following intravenous and oral administrations of emodin to rats[J].J Pharm Sci,2010,99(4): 2185-2195.

[8]Wang LX,Yuan WW,Scott R,et al."Hydrolysis of PhaseⅡConjugates for LC-MS Bioanalysis of Total Parent Drugs."[J]Handbook of LC-MS Bioanalysis:Best Practices,Experimental Protocols,and Regulations,2013,1:471-477.

Identification of known chemicals and their metabolites in rat plasma after oral administration of SuoQuan capsules using LC-MS/MS(Ⅱ).

CHEN Feng1,2,LI Hai-long1,2,LAI Wei-yong1,2,TAN Yin-feng1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study enzymatic hydrolysis of the flavonoids'(tectochrysin,izalpinin,chrysin, kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)metabolites in rat bile after oral administration of SuoQuan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.),and the bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After β-glucuronidase(1000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment,these phaseⅡmetabolites in rat bile samples were hydrolyzed and their aglycones were analyzed using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsAfter β-glucuronidase treatment,the mono-or di-glucuronide metabolites of Yizhi flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)could not be detected.On the contrast, the corresponding aglycones were librated from their conjugated forms.However,the O-demethylation metabolites of izalpinin and apigenin-4',7-dimethylether could not be measured,although their glucuronidated conjugates had been found in the rat bile samples.ConclusionThe enzymatic hydrolysis via β-glucuronidase is helpful for the identification of Yizhi flavonoids'phaseⅡmetabolites.Meanwhile,this paper also lays a partial foundation for quantitative analysis of these aglycones.

Suoquan capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Flavonoids;Enzymatic hydrolysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）16—2347—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0918

2014-03-27)

海南省自然科學基金項目(編號：812189，813188)

譚銀豐。E-mail：112552819@qq.com