超聲波輔助提取明日葉查爾酮的工藝優化

寧鴻珍，陳欣華，王曼曼，王茜，劉楠，馬東，王丹丹，高勝海

（河北聯合大學公共衛生學院，河北省煤礦衛生與安全實驗室，河北唐山063000）

明日葉（Angelica keiskei）又名八丈芹，長壽菜，海峰人參，是傘形科多年生草本植物，原產于日本國伊豆、八丈諸島[1]。明日葉被譽為“21世紀的健康食品”，富含多種維生素、礦物質等營養成分和查爾酮等生物活性物質[2]，在營養和醫療保健方面有重要功能，作為綠色食品具有廣闊的發展前景。查爾酮是植物體內合成黃酮的前提，是一種重要的植物色素，其基本骨架為1，3-二苯基丙烯酮[3]。據報道[4-8]，查爾酮對腫瘤有明顯的抑制作用、還有強烈的抗菌作用、同時有抗衰老、抗血栓、降血壓、抗過敏、抗癌、抗艾滋病、防癡呆癥、防糖尿病等諸多功效，也常被用做利尿通便劑、興奮劑和催乳劑，具有很高的醫學研究價值。目前，國內外對明日葉中查爾酮的提取大多采用的是溶劑浸提法，但暴露出很多問題，如能量消耗大、提取時間長、提取率低等問題，而新興技術如超聲波提取技術、微波提取技術等具有簡單方便、提取時間短、提取率高等優點，目前尚未見超聲波輔助提取明日葉中查爾酮的工藝研究報道。本文采用超聲波輔助提取工藝對明日葉中的查爾酮進行提取研究，通過正交試驗優化提取條件[9]，并對明日葉中查爾酮含量進行測定，為明日葉的進一步開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明日葉：購自山東明日葉莊園；查爾酮標準品：由上海阿達瑪斯有限公司生產；無水乙醇和石油醚均為分析純：由天津市富宇精細化工有限公司生產；甲醇為色譜純：購于Sigma公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；EYELER離心濃縮儀：日本東京理化器械株式會社；LGJ-12冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 查爾酮標準曲線的繪制

確稱取查爾酮標準品5 mg，用甲醇定容50 mL容量瓶中，配成100 μg/mL的標準儲備液，吸取該標準儲備液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，配置成 1、2、5、10、20 μg/mL 的查爾酮標準溶液。用紫外可見分光光度計分別對1、2 μg/mL的標準品溶液進行全波段掃描，在308 nm處顯示最大吸收，并呈現出計量關系，選定308 nm為最大吸收波長。在波長為308 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立吸光度和濃度之間的線性關系，繪制標準曲線，得出回歸方程：y＝0.079 8x-0.011 1，R2＝0.999 5，如下圖1所示。

圖1 查爾酮標準曲線Fig.1 The standard curve of chalcone

1.2.2 樣品處理

新鮮的明日葉莖葉用去離子水反復沖洗，沖洗后于50℃鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎，研磨，過40目篩。干燥至恒重，儲存于干燥器中備用。

1.2.3 明日葉中查爾酮的提取與測定

稱取0.5 g明日葉干粉，置于玻璃試管中，加入提取溶劑乙醇溶液[10]，水浴控溫，設定提取條件，用超聲波細胞破碎機對明日葉查爾酮進行輔助提取。提取液離心，取上清液，用2 mL～3 mL溶劑洗滌濾渣，離心，吸取上清液，合并提取液；利用石油醚反復萃取提取液[11]，去除其中的葉綠素，直至石油醚無色；將濾液離心濃縮，冷凍干燥，得到明日葉中查爾酮的粗提取物，用甲醇轉移定容至25 mL容量瓶中作為待測溶液。取1 mL待測液用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用紫外一可見光分光光度計在308 nm波長下測定吸光度，代入回歸方程，計算查爾酮得率。

1.2.4 單因素試驗

準確稱取明日葉干粉0.5 g，置于玻璃試管中，超聲波輔助提取，以明日葉查爾酮得率為指標，分別研究超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間對明日葉查爾酮得率的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間進行5因素3水平正交試驗，分析各因素影響的主次并確定其最優提取工藝參數。每次實驗做3個平行樣，結果取平均值。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲功率對查爾酮提取效果的影響

超聲功率分別選用 100、200、300、400、500 W，實驗在料液比1∶40、乙醇濃度為70%、冰浴、提取時間30 min（工作3 s，間歇5 s）的條件下進行。

圖2 超聲功率對提取效果的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extracting result

結果如圖2所示，隨著功率提高，吸光度上升，當功率為300 W時，提取效果最好，隨后隨著功率的升高，提取效果反而下降。這可能是因為功率太大時，超聲工作期間產熱越高，提取物被破壞，溶劑蒸發過快，導致提取效率下降。所以選擇300 W為最佳提取功率。

2.1.2 不同濃度乙醇對提取效果的影響

用于明日葉有效成分的提取溶劑有甲醇、正己烷、丙酮、乙醇等，由于甲醇、正己烷、丙酮、對人體健康不利，并且乙醇可有效降低查爾酮酶的活性，避免提取時查爾酮的分解，故選擇乙醇作為提取溶劑。適當濃度的乙醇溶液可以大大增加提取物在提取液中的溶解度，從而減少溶劑用量，增大提取效率。實驗分別選用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，其余條件為超聲功率300 W，料液比1∶40，冰浴，提取時間30 min（工作 3 s，間歇 5 s）。

圖3 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extracting result

結果如圖3可知，明日葉中的查爾酮提取效果隨乙醇濃度的增加而升高，濃度達到70%時提取效果最好，之后提取效果反而下降了。這可能是由于乙醇濃度過高時，溶劑極性下降，查爾酮的溶解度下降，不利于查爾酮的溶出。同時一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，與查爾酮競爭與溶劑的結合，從而導致提取效果下降。

2.1.3 不同提取溫度對提取效果的影響

合適的提取溫度能加快提取物的溶出，但溫度過高，不僅增大了能耗，還有可能導致提取物的分解，從而降低了提取效率。實驗在超聲功率300 W，料液比1 ∶40，乙醇濃度 70%，提取時間 30 min（工作 3 s，間歇5 s）的條件下，分別探討 50、60、70、80 ℃的提取溫度對提取效率的影響。

圖4 提取溫度對提取效果的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the extracting result

結果如圖4所示，明日葉中的查爾酮提取效果隨提取溫度的上升而升高，溫度達到70℃時提取效果最好，之后提取效果反而下降，故選擇70℃為最佳提取溫度。

2.1.4 不同料液比對提取效果的影響

料液比高必然會增大兩相間濃度差，增大傳質推動力，提取效率也會相應增大，但也會提高生產成本及增加后續處理的難度。在超聲功率為300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為70℃，提取時間30 min（工作3 s，間歇5 s）的實驗條件下，料液比分別選用 1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70 進行實驗。

圖5 料液比對提取效果的影響Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on the extracting result

實驗結果如圖5所示，隨料液比的增大，提取效果越好，但當液料比達到1∶40后，增加緩慢，考慮到提取率、生產成本和后續處理難度的問題，實驗確定最佳料液比為1∶40。

2.1.5 不同提取時間對提取效果的影響

實驗在超聲功率300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為70℃，液料比為1∶40的前提下，分別提取10、20、30、40、50 min（工作 3 s，間 5 s）。

圖6 提取時間對提取效果的影響Fig.6 Effects of extraction time on the extracting result

實驗結果如圖6所示，當提取時間為10 min～20 min時，隨超聲波作用時間的延長，查爾酮吸光值逐漸增大，但超聲波處理時間超過20 min后吸光值有明顯下降，這可能是長時間處理導致溶劑揮發的緣故，當提取時間為20 min時，提取效果最好。

2.2 正交試驗結果

根據以上單因素實驗結果，選取超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時間按5因素進行正交實驗設計，以確定超聲輔助提取明日葉中查爾酮的最佳工藝。正交實驗因素水平表見表1，實驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

由表2的極差分析和表3的方差分析結果可知，料液比對明日葉查爾酮提取量影響最大，其次為乙醇濃度和提取溫度，提取時間和超聲功率對其影響較小。表3方差分析結果表明：在95%置信水平下，從明日葉提取查爾酮的工藝參數中，功率和時間對明日葉提取效率影響不顯著，濃度、溫度和料液比影響顯著。綜合極差分析和方差分析可知本實驗的最佳工藝為A2B2C1D3E2，即超聲波功率300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為50℃，料液比為1∶50，超聲時間為20 min。

表2 正交試驗結果表Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance

2.3 工藝驗證

取3份試樣各0.5 g，按最佳提取方法進行提取，吸光值分別為1.096，1.110，1.104。計算得明日葉中查爾酮得率為6.98 mg/g。均高于正交試驗中各實驗組合的查爾酮得率，與正交試驗分析結果相符。

2.4 明日葉中查爾酮提取率的測定

在最佳的提取工藝條件下，對明日葉中的查爾酮的提取率進行測定。結果見圖7。

圖7 提取次數對提取效果的影響Fig.7 Effects of extracting times on the extracting result

由圖7可知，隨著提取次數的增加，查爾酮的提取率也增加。但提取次數超過2次后，查爾酮的提取率增加很少，所以在最佳的提取工藝條件下，提取2次后吸光值為1.191，明日葉查爾酮的得率為7.53 mg/g。

3 結論

本文所探討的5個因素超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間，對明日葉查爾酮提取量的影響主次順序是：料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞超聲功率。提取工藝條件為超聲波功率300 W，乙醇濃度70%，提取溫度為50℃，料液比為1∶50，提取時間為20 min。在此條件下提取2次，明日葉中查爾酮得率為7.53 mg/g。

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