阿魏菇多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

劉冰，許程劍，*，王月香，孫然，牛博楠，盧士玲，李應(yīng)彪

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院老干一科，新疆石河子832000）

阿魏菇又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑，因其生長(zhǎng)在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子實(shí)體具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。據(jù)報(bào)道[1-2]阿魏菇屬高蛋白、低脂肪、高碳水化合物、高纖維素營(yíng)養(yǎng)食品。其中多糖含量在10%以上，阿魏菇中所含的多糖是重要的生物活性成分，具有增強(qiáng)人體免疫力，減少輻射危害、抗腫瘤調(diào)節(jié)人體生理平衡等作用。多糖的生物活性決定于其自身結(jié)構(gòu)，了解多糖的基本組成和簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)是研究多糖藥理活性的理論基礎(chǔ)。近幾年，有關(guān)阿魏菇多糖的研究較少，原子力顯微鏡（AFM）觀察阿魏菇多糖分子的微觀結(jié)構(gòu)也未見(jiàn)報(bào)道[3-5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)阿魏菇多糖進(jìn)行提取、分離純化，通過(guò)薄層色譜分析單糖組成，并利用紅外光譜和原子力顯微鏡對(duì)純化分級(jí)的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，這為系統(tǒng)的研究阿魏菇多糖的組分、結(jié)構(gòu)及進(jìn)一步弄清其構(gòu)效活性關(guān)系提供了理論參考，在功能性食品的開發(fā)和阿魏菇的深加工等方面具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏菇（新疆清河）；DEAE-Cellulose和Sephadex G-100（Pharmacia公司）；濃硫酸、苯酚、苯胺、鄰苯胺、無(wú)水乙醇、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、正丁醇、過(guò)硫酸銨、阿里新蘭染色液、氯化鈉、氫氧化鈉、溴化鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Ultrospec-5300紫外分光光度儀：日本島津公司；ZXRD-7080鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；D36mm透析袋（XH419）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ENK-PRO酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-teck生產(chǎn)；HX-DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器：京恒奧德儀器儀表有限公司；ZD11-WD121紅外分析儀器：北京中西化玻儀器公司；KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HL-1恒流泵：蘇州江東精密儀器有限公司；Nano-R2原子力顯微鏡：上海實(shí)密國(guó)際貿(mào)易有限公司；GRX-9073A熱空氣消毒箱：上海一恒科技有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司；DYY—Ⅲ6B電泳儀：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏菇粗多糖制備

挑選新鮮阿魏菇，剪碎并打漿后，在超聲輔助下[6]熱水浸提5 h，4層紗布過(guò)濾，然后離心除去雜質(zhì)，收集濾液，濃縮到適當(dāng)體積。經(jīng)Savage法除蛋白[7]，然后加入4倍體積、濃度為100%的乙醇，在4℃下醇沉?xí)r間12 h。所得沉淀用75%乙醇洗滌2次，然后用60℃蒸餾水溶解，離心去除雜質(zhì)，取上清液繼續(xù)醇沉，所得絮狀沉淀物質(zhì)即為阿魏菇粗多糖。繼續(xù)加水溶解，透析2 d后冷凍干燥得阿魏菇總多糖。

1.2.2 阿魏菇多糖的分離與純化

1.2.2.1 多糖的凝膠層析

將冷凍干燥得到的多糖20 mg溶解到5 mL蒸餾水里，6 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)凝膠柱DEAE-Cellulose，用不同濃度的NaCl洗脫[8]，并用全自動(dòng)數(shù)據(jù)收集器收集洗脫液。然后用苯酚-硫酸法[9]測(cè)定每管多糖含量。將獲得的組分真空冷凍干燥后，再通過(guò)Sephadex G-100時(shí)用蒸餾水洗脫，并收集洗脫液，同樣方法測(cè)多糖含量。

1.2.2.2 多糖小分子的脫除

粗多糖中含有各種分子量大小的雜質(zhì)，包括一些小分子物質(zhì)，而多糖自身的分子量較大。透析膜可以通過(guò)膜內(nèi)外溶液的濃度差實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換，依濃度梯度從濃度高的一側(cè)向濃度低的一側(cè)移動(dòng)，而水分子則按滲透梯度從滲透濃度低的一側(cè)流向滲透濃度高的一側(cè)，因此多糖去蛋白液中的小分子物質(zhì)能通過(guò)膜遷移到溶液中去，大分子物質(zhì)則留在膜內(nèi)，從而將阿魏菇多糖小分子脫除。

1.2.2.3 多糖得率計(jì)算

式中：C為根據(jù)吸光度計(jì)算出的葡萄糖濃度，（mg/mL）；V為不同的液料比比值；N為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后稀釋的倍數(shù)；M為阿魏菇樣品的重量，g。

1.2.2.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)已有研究[6]，選擇影響多糖得率的幾個(gè)因素：超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察各因素對(duì)阿魏菇多糖得率的影響。并以此為試驗(yàn)因子，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

1.2.3 阿魏菇多糖的分析鑒定

1.2.3.1 多糖的薄層色譜分析

多糖的水解[10]：取純化后樣品10 mg于安瓿瓶中，加入2 mol/L的H2SO45mL，密封，振蕩至樣品完全水解，然后置于110℃烘箱中反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，加BaCO3中和，在3 000 r/min的離心機(jī)中離心取上清液備用。采用薄層色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，薄層板以含3%CMC和3%的硅膠G鋪板，展開劑為正丁醇：丙酮：水（4∶3∶1），將水解后的多糖與標(biāo)準(zhǔn)單糖在薄層板上每隔1.5 cm用毛細(xì)管點(diǎn)樣，吹干后室溫下置層析缸內(nèi)自下向上展開，當(dāng)展開劑到達(dá)離薄層板頂端約1 cm處取出薄層板，前沿做記號(hào)，60℃烘干2 h～3 h（或者薄層板在空氣中晾干）后噴灑苯胺-鄰苯胺顯色劑，于110℃烘箱中加熱10 min，根據(jù)不同單糖的顯色顏色不同和展開距離不一樣來(lái)判斷多糖中單糖的組分。

1.2.3.2 多糖的紫外光譜分析

將多糖配置成濃度為500 mg/mL的水溶液，用紫外光譜儀測(cè)定波長(zhǎng)200 nm～400 nm的紫外光譜。

1.2.3.3 多糖的紅外光譜分析

將干燥的分離純化阿魏菇多糖組分1mg于潔凈的瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨成細(xì)粉，再加入約100mg干燥的KBr一起研磨至二者完全混合均勻，顆粒粒度約為2 μm以下。取適量的混合樣品于潔凈的壓片模具中，制成透明試樣薄片，要求壓片不可太厚。以不加多糖樣品的KBr為空白，同樣方法制樣片。將試樣薄片裝在磁性樣品架上，放入紅外光譜儀的樣品室中，在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜掃描，先測(cè)空白背景，再將樣品置于光路中，測(cè)定樣品紅外光譜，進(jìn)行修正，觀察譜峰情況。

1.2.3.4 多糖原子力顯微鏡（AFM）觀測(cè)

準(zhǔn)確稱取1mg分離純化的組分。配制成20 μg/mL多糖溶液，冷卻至室溫，再稀釋至2 μg/mL。用移液槍吸取3 μL多糖溶液，滴在新鮮解離的云母片上，空氣中干燥大約20 min，待樣品干燥后即可進(jìn)行原子力顯微鏡（AFM）觀測(cè)。

1.2.3.5 多糖凝膠電泳測(cè)定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠法：將阿魏菇多糖C溶解于蒸餾水中，配成5 mg/mL的多糖溶液，備用。配制5%分離膠和3%的濃縮膠并處理樣品溶液，衡壓40 v進(jìn)行電泳，再以阿里新蘭染色。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 透析

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用截留分子量為8×103～1.2×104的透析袋進(jìn)行透析，可以達(dá)到理想的效果。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究表明超聲時(shí)間70 min、超聲功率160 W、超聲溫度60℃、液料比為30∶1為最佳工藝，阿魏菇多糖的平均得率為11.08%[6]。

2.3 多糖組分純化

圖1為阿魏菇總多糖通過(guò)DEAE-Cellulose后，苯酚-硫酸法測(cè)定每管多糖的含量而得。

圖1 阿魏菇多糖DEAE-Cellulose洗脫圖Fig.1 Mushrooms polysaccharide on DEAE-52 elution diagram

由圖1可以看出，洗脫曲線有兩個(gè)峰，表明阿魏菇總多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52分離純化出兩種組分，分別命名為A、B。對(duì)圖1所得的A、B組分進(jìn)行收集合并冷凍干燥，所得樣品進(jìn)行Sephadex G-100的凝膠層析柱，得到兩個(gè)洗脫峰，見(jiàn)圖2。

圖2 阿魏菇多糖Sephadex G-100洗脫圖Fig.2 Mushrooms polysaccharide Sephadex G-100 elution diagram

同樣收集合并經(jīng)冷凍干燥得純品阿魏菇多糖命名C。多糖是大分子化合物，即使是純品，其微觀也是不均一的。它的純度只代表某一多糖的相似鏈長(zhǎng)的平均配布。同時(shí)，根據(jù)聚電解質(zhì)效應(yīng)，考慮到多糖組分在水中可能有弱的電離，濃度越低電離度越大，大分子所帶電荷越多，促使原來(lái)蜷曲的大分子鍵伸展開來(lái)；另外，溶液越稀，水分子越易向大分子內(nèi)部擴(kuò)散，使其體積膨脹。大分子團(tuán)的膨脹和分子鍵的伸展造成了洗脫體積的增大。這也說(shuō)明了采用不同方法檢驗(yàn)多糖純度是必要的。

2.4 薄層色譜分析結(jié)果

薄層色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 阿魏菇多糖薄層色譜分析圖Fig.3 TLC analysis of mushrooms polysaccharide

圖中1至6點(diǎn)樣分別是葡萄糖、果糖、樣品、半乳糖、木糖、甘露糖。通過(guò)薄層色譜分析，對(duì)比于各單糖的展開效果及顯色效果，結(jié)果表明總多糖可能是由半乳糖，葡萄糖，果糖，甘露糖組成。有研究表明[11]，一些多糖的抗腫瘤活性強(qiáng)弱與其甘露糖含量呈現(xiàn)正相關(guān)，但是對(duì)于降血糖活性是否存在這樣的關(guān)系有待進(jìn)一步考證。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合對(duì)比幾種分析多糖的單糖組成成分的方法，最后采用TLC法，其操作簡(jiǎn)單，快速，但由于多糖水解成單糖后其極性相近，因此有可能會(huì)達(dá)不到理想效果，有待進(jìn)一步研究。

2.5 多糖的紫外掃描結(jié)果

多糖的紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 阿魏菇多糖紫外光譜圖Fig.4 The UV spectrum of mushrooms polysaccharide

由圖4可知，阿魏菇的多糖紫外光譜為典型的多糖光譜，在260、280 nm處無(wú)吸收峰，表明無(wú)核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

2.6 多糖紅外分析結(jié)果

多糖紅外分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 阿魏菇多糖紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of mushrooms polysaccharide

阿魏菇多糖C組分用KBr壓片法，在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)攝得紅外光譜，主要吸收峰有3 417.8、2 926.7、1 738.6、1 643.6、1 152.5、1 025.7 cm-1，通過(guò)紅外圖譜可以看出，在3 417.85 cm-1處有強(qiáng)峰值，表明有多糖分子間或分子內(nèi)的氫鍵，是O-H的伸縮振動(dòng)峰，由于羥基形成氫鍵，吸收峰變寬，2 926.7 cm-1處有一中強(qiáng)強(qiáng)吸收峰，為糖鏈中次甲基（-CH2-）C-H伸縮振動(dòng)引起，在這個(gè)區(qū)域的兩組吸收峰是糖類的特征峰；在 1 738.6 cm-1和1 643.6、1 026.7 cm-1和1 152 cm-1的吸收峰是吡喃糖環(huán)的兩種C-O伸縮震動(dòng)引起的，其中一種屬于C-O-H，另一種屬于糖環(huán)的CO-C。

2.7 多糖原子力分析結(jié)果

多糖原子力分析結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 阿魏菇多糖AFM分析圖Fig.6 AFM analysis of mushrooms polysaccharide

從純品阿魏菇多糖組分AFM分析圖像中可以看出多糖分子鏈呈現(xiàn)出分枝結(jié)構(gòu)，糖鏈的密度依賴于其初始密度及其沉積到云母片表面的量；圖像的對(duì)比度依賴于針尖的作用力，作用力太大易損壞糖鏈，而太小則對(duì)比度差，難得到較清晰、穩(wěn)定的圖像。從圖像中可以看到，多糖分子鏈及其多個(gè)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，這些側(cè)鏈結(jié)構(gòu)鏈間通過(guò)單元間不同的鏈接方式衍生出環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而鏈呈多股緊密的螺旋狀結(jié)構(gòu)可能與多糖中分子間的Vander Waals相互作用以及糖鏈間氫鍵締合有關(guān)。

2.8 多糖電泳結(jié)果

多糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 阿魏菇多糖電泳結(jié)果圖Fig.7 Electrophoresis results of mushrooms polysaccharide

聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果表明，阿魏菇多糖呈區(qū)帶相對(duì)集中。阿魏菇多糖C為均一組分，達(dá)到了電泳純級(jí)的樣品。

3 結(jié)論

本文以阿魏菇為研究對(duì)象，對(duì)其粗多糖的制備，多糖的分離與純化，多糖的純度鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，同時(shí)利用薄層分析法，紅外分析，電泳，AFM等一系列方法分析研究其多糖的組分及結(jié)構(gòu)。阿魏菇總多糖進(jìn)行除蛋白后，通過(guò)薄層色譜分析出總多糖可能由半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖組成，通過(guò)DEAE-52 Cellulose凝膠柱及Sephadex G-100凝膠柱分離純化出阿魏菇純品多糖C。將多糖C進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，表明其為均一組分。同時(shí)進(jìn)行了紅外光譜和原子力分析，表明阿魏菇多糖分子具有高度分枝的結(jié)構(gòu)。

4 討論

阿魏菇是新疆特有的菌類之一，來(lái)源豐富，阿魏菇多糖的提取分離具有一定的可信性和可行性。多糖類化合物由于它們的獨(dú)特功能和很低的毒性在腫瘤的治療和預(yù)防上優(yōu)于其它化合物，因此多糖作為藥品或保健食品的應(yīng)用將有廣闊前景。隨著對(duì)多糖生物活性的研究，尤其是糖組學(xué)的進(jìn)一步深入，多糖的生物活性機(jī)理、功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?huì)更加拓寬。

有關(guān)本實(shí)驗(yàn)的多糖研究方法還有很多，不同的研究方法可能會(huì)得到部分的差別，由于時(shí)間和條件的限制，本試驗(yàn)只是初步的研究，還有待進(jìn)一步的研究與探討。

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