致瀉性大腸桿菌基因芯片檢測方法的建立

王乃福，吳冬雪，張霞，劉培，張海英，高旗利

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300456）

致瀉性大腸桿菌（DEC）是細菌性腹瀉的常見病原菌，它包括腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）和腸聚集性大腸桿菌（EAEC）。據世界衛生組織統計，全世界每年有10億人患腹瀉，其中5億人發生在第三世界，導致每年5百萬嬰幼兒死亡，雖然不同地區的自然環境和生產、生活方式有所差異，引起腹瀉病的主要病原體有所不同，但致瀉性大腸桿菌是近年來國內外十分關注的引起人類臨床腹瀉和食物中毒的重要病原菌，由致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例數始終位于第二位，可見大腸桿菌腸道傳染的廣泛性[1]。大腸桿菌O157是近年來新發現的危害嚴重的腸出血性大腸桿菌血清型，同其他血清型致瀉性大腸埃希氏菌相比，O157血清型致病性更強，最低致病劑量更低，患者發病后病死率較高。自1982年美國首次發現該血清型以來，在世界上很多國家相繼發生了爆發和流行，現已成為全球性的公共衛生問題之一。目前，我國致瀉性大腸桿菌的檢測仍以血清型檢測為主，但由于此方法假陽性率比較高，所需檢驗時間較長，已越來越不能滿足快速發展的國際貿易、食品安全突發事件的需要，必須尋求一種高通量診斷方法一次鑒定多個致瀉性大腸桿菌血清型。基因芯片技術是近年來興起的一種基因診斷技術，該技術具有快速、敏感、高效、平行化、自動化等特點，既可以應用許多不同的探針來檢測同一靶基因以降低假陽性率，還可以通過集成多種病原的基因探針來對病原體進行快速的診斷、鑒別診斷與基因分型[2]。自1995年被應用以來，已廣泛應用于基因圖譜繪制、基因表達分析、疾病診斷、藥物篩選、疫苗研制、環境監測等多個領域[3-5]。本試驗運用基因芯片技術，擬建立一種針對包括EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 和 大 腸 埃 希 氏 菌O157血清型的診斷方法，以期進一步提高實驗室診斷效率，為臨床疾病診斷、食物中毒檢測、進出口食品檢疫、流行病學調查等工作提供有效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及來源

腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157來自德國大腸桿菌國家實驗室，沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌來自中國醫學微生物菌種保藏管理中心，非致瀉型大腸桿菌為本實驗室分離保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：ExTaq DNA聚合酶：dNTPs購自大連寶生物工程有限公司，細菌培養基均購自北京陸橋技術有限責任公司，細菌基因組提取試劑盒購自QIAGEN公司。

儀器：恒溫培養箱Binder，德國；PCR儀Biometra，德國；水浴箱Shellab，美國；雜交培養箱HybriLinker，美國；芯片點樣儀PerkinElmer，美國；共聚焦激光掃描儀GenePix 4000B，美國。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計和探針的合成

根據Genbank中腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157的序列，通過序列比對，篩選出特異DNA序列。由于Genbank上這些菌株的序列資源較為豐富，分析這些特異序列之后進行目的基因的篩選，并根據目的基因設計相應的引物和探針，得到了針對各種菌株特異目的基因的PCR引物9對，探針23條。同時設計負對照探針Cy3-（T）40。使用工具Primer premier 5.0軟件進行設計且所有引物和探針設計完成后，使用ClustalX 1.83進行基因序列特異性比對，以確保引物和探針之間的特異性。引物和探針均由上海生物芯片有限公司合成。

1.2.2 菌株的培養

大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌用NA培養基37℃過夜培養，然后挑取3個～4個菌落接種到LB液體培養基，在培養箱經過37℃培養24 h。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養24 h，然后挑取3個～4個菌落接種到氯化鈉結晶紫增菌液，37℃增菌8 h～16 h。產氣莢膜梭菌挑取適量的菌種接種到SPS培養基，37℃厭氧培養24 h～48 h，挑取黑色菌落于液體硫乙醇酸鈉中增菌。金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌用TSA血平板37℃過夜培養，取3個～4個菌落接種到LB液體培養基，37℃培養24 h。

1.2.3 DNA的提取

細菌DNA的提取按照QIAGEN公司細菌基因組提取試劑盒使用說明中得操作規程進行提取。

1.2.4 多重PCR擴增

將腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157的多個目的基因分為兩組進行多重PCR擴增。第一組為 Stap、Stah、wzy、ipaH、eae，第二組為 LT、stx1、stx2、aggR。反應體系為10×PCR緩沖液，2.5μL；dNTP，0.5μL；上游引物各0.2μL；下游引物各0.8μL；模板 DNA，5μL；Taq酶，0.3 μL；去離子水補足 25 μL。PCR 反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個循環；72℃ 5 min。

1.2.5 芯片的制備

將探針加入到384孔板中相應的位置，每孔加入10 μL探針。利用PerkiElmer公司的SpotArray微陣列點制系統基因芯片點樣儀將384孔板中的探針點到玻片上，每條探針重復點樣3次。點好的芯片在室溫下過夜干燥，然后45℃烘箱干燥2 h。干燥后的芯片放回潔凈的芯片盒中避光保存備用。點樣陣列為7×4，每個芯片上共點8個陣列。芯片上探針排列見下圖1。

1.2.6 基因芯片的雜交

將雜交液置65℃烘箱中預熱15 min，混勻10 μL預熱的雜交液、6 μL去離子水、第一組和第二組PCR混合液產物各2 μL混勻后98℃變性5 min，立即置于冰上5 min；取雜交倉，在底部凹槽內均勻的加入200 μL去離子水，將變性后的雜交混合液全部垂直加入蓋片加樣孔中，組裝好雜交倉，放入60℃水浴鍋中，雜交2 h。將雜交好的基因芯片取出，依次在洗液Ⅰ中輕柔提洗3 min，洗液Ⅱ中輕柔提洗3 min，95%乙醇中輕柔提洗90 s，使用吹風機快速吹干。

圖1 芯片點陣示意圖Fig.1 Schematic diagram of probe square of the chip

1.2.7 基因芯片的結果判定

芯片用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀掃描，使用532 nm單色熒光、100%Power Gain、10μm分辨率，根據信號點的熒光強度調節光電倍增管（PMT）值至650，利用GenePixPro軟件得到每個探針位點的熒光信號強度值，用cutoff值（SNR=3.5）去除信號低的探針，只有高于cutoff值的探針信號被視為有效信號。

1.2.8 基因芯片的特異性檢測

用制備的基因芯片和上述雜交方法，對本研究檢測的多種致瀉性大腸桿菌和沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌、非致瀉型大腸桿菌等近緣菌株進行多重PCR擴增和芯片雜交檢測，驗證制備基因芯片的特異性。

1.2.9 基因芯片的靈敏度檢測

采用“添加檢出”的方式，將腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157純菌培養液10倍梯度稀釋（100cfu/mL～108cfu/mL），分別各取 10 mL 純菌培養液提取基因組，用于進行多重PCR試驗和芯片雜交檢測。本研究選取大腸桿菌O157（882364株）wzy基因進行純菌的靈敏度試驗。

1.2.10 基因芯片檢測方法的實際應用

采用建立的基因芯片檢測方法，對從市場、超市等購買48份食品樣品進行檢測。

2 結果

2.1 多種致瀉性大腸桿菌PCR擴增

對 EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大腸桿菌O157進行擴增，均得到預期目的片段，表明針對各病原引物特異性良好。

2.2 雜交特異性試驗

在多重PCR試驗成功的基礎上，使用所設計的每一條探針，對相應的菌株DNA進行檢測，每個標準菌株DNA檢測結果見圖2。

圖2 標準菌株芯片雜交結果Fig.2 Hhybridizated results of standard strains

從圖2中可以看出，所設計的探針對相應的菌株檢測均可以得到正確的檢測結果。另外使用沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌、非致瀉型大腸桿菌等8株近緣菌株進行多重PCR擴增和芯片雜交檢測，檢測結果見圖3。

圖3 8株近緣菌株雜交結果Fig.3 Hybridizated results of eight closely related bacterial strains

從圖3中可以看出，8株近緣菌芯片中均未出現所研究的 EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大腸桿菌O157的目的基因的檢測信號。

2.3 芯片靈敏度試驗

選取大腸桿菌O157（882364株）wzy基因進行純菌的靈敏度試驗，檢測結果見圖4。

圖4 大腸桿菌O157靈敏度試驗Fig.4 Sensitivity test of Escherichia coli O157

由圖4可知，芯片對大腸桿菌O157的檢測靈敏度為104cfu/mL。本方法2次檢測結果相同，表明該方法具有良好的可重復性。其它致瀉性大腸桿菌的檢測靈敏度結果見表1。

表1 各致瀉性大腸桿菌純菌靈敏度Table 1 The sensitivity of the diarrheagenic Escherichia coli bacteria respectively

2.4 實際樣品的檢測

從市場、超市等購買如下食品（見表2），并分別編號，采用我們建立的致瀉性大腸桿菌的檢測方法，進行檢測。

表2 檢測的實際樣品Table 2 The samples detected

檢測結果顯示：第11號生豬肉樣品檢出毒力基因eae，第16號生豬肉樣品檢出毒力基因lt。全部實際樣品經國標的血清學檢測方法確認，兩種方法檢測結果完全一致。單純48例實際樣品檢測結果而言，該方法檢測的準確性為100%，假陽性和假陰性率均為0%。

3 討論

多重PCR是在同一PCR體系中同時加入多種病原微生物的特異性引物進行PCR擴增。多重PCR與單重PCR相比，大大提高了效率，在同一PCR反應管內可同時檢出多種病原微生物，節省了時間，減少了費用。基因芯片技術具有快速、準確、高通量、自動化等特點。運用基因芯片技術檢測致病菌的同類研究已有報道。多重PCR與基因芯片技術的整合可以實現兩種技術的優勢互補，通過PCR的基因放大作用和芯片的熒光探針雜交技術使此種檢測體系達到較高的靈敏度和特異度[6-7]。本研究綜合了多重PCR和基因芯片技術的優勢，采用多重PCR和基因芯片聯用的技術，建立了高通量芯片檢測方法，可以高效特異的檢測多種致瀉性大腸桿菌，純菌檢測靈敏度可達104cfu/mL，達到較高的檢測靈敏度，這與其他文獻報道相一致[8-9]。所建立的多種致瀉性大腸桿菌基因芯片檢測方法可作為一種有效的初篩方法應用于出入境檢驗檢疫局、食品工廠等部門檢查食品的安全，同時，為流行病學調查和傳染性疾病的早期診斷和判定提供了一種有效的檢測手段。

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