雞油菌中總黃酮含量的測定及抗氧化活性研究

郭豫梅

（陜西理工學院化工學院，陜西漢中723001）

雞油菌別名黃絲菌、杏菌，是一種外生菌根真菌，屬真菌界、擔子菌門、同擔子菌綱、雞油菌目、雞油菌科和雞油菌屬[1]。其實體肉質，全菌杏黃色、蛋黃色或枇杷黃色，有濃郁的杏仁果香味，微甜，肉質內實。多見于夏秋季，常生于排水良好的緩坡上的針闊葉林地上，如松樹下腐爛的松毛下面或麻櫟下的草叢里，群生或近叢生。在我國主要分布于貴州、云南、黑龍江、江蘇、青海、四川、西藏等地[2]。研究表明，該菌性平，味甘，有清目利肺、益腸胃之功效，經常食用可治療VA缺乏所引氣的皮膚粗糙或干燥癥、夜盲癥、視力失常、眼炎等疾病以及預防某些呼吸道感染的疾病。據報道，該菌試驗有抗癌作用，對小白鼠肉瘤180抑制率為60%，對艾氏癌的抑制為70%，另有抑制和抗某些細菌的作用[3]。

經實驗表明，黃酮類化合物對心血管、腦血管、腫瘤等方面均有顯著的藥理作用，說明此類化合物確有多種生物活性[4]。該類化合物種類繁多，存在植物體中含有多重藥理作用，如黃蜀葵花總黃酮可以保護心肌受損、抗心絞痛、保護缺血性腦損傷；銀杏黃酮則具有鎮痛、降血壓、抗凝血、保護腦血管等作用。故其作為新藥研究開發的先導化合物，是一個值得重視的資源，具有重要的現實應用意義[5-6]。但有關雞油菌黃酮類化合物抗氧化活性方面的研究還未見報導，本文采用醇浸提取雞油菌中總黃酮類化合物，并主要研究其抗氧化活性。所得結果可為雞油菌在食品、醫藥等領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

雞油菌：購于陜西漢中。

1.1.2 試劑

蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所，純度≥99%；乙醇、亞硝酸鈉溶液、氫氧化鈉、硝酸鋁溶液、鄰苯三酚、抗壞血酸（VC）、鄰二氮菲、對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘已二胺溶液均為分析純。

1.1.3 儀器

GR-200電子分析天平：日本AND；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；101型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 方法

取雞油菌樣品在干燥箱中70℃干燥，粉碎，過100目篩。用天平精確稱取15.000 0 g的樣品，放入燒杯中，加入200 mL 85%的乙醇溶液，在70℃下浸提20 h。抽濾，得總黃酮提取液[7]。

1.2.1 標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁樣品5.000 0 mg，置50 mL容量瓶中,用30%乙醇適量置水浴上加熱溶解，放冷，再用30%乙醇稀釋至刻度,搖勻。量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 分別置于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5.0 mL，然后加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用30%乙醇稀釋至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以試劑同法操作作為空白，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度（A）為橫坐標，濃度（C）為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1），得到回歸方程為：C=0.091 2A+0.026 3（R=0.999 7）。

圖1 蘆丁的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.2 含量的測定

分別精確量取待測液0.1 mL，加入9.9 mL的30%乙醇，置于25mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL搖勻，放置6 min，10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用30%乙醇稀釋至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以試劑同法操作作為空白，在波長510 nm處測定吸光度。通過回歸方程計算出溶液濃度（C）（單位g/L）。再運用計算公式：T=C（g/mL）×10×N×50 mL/5 000 mg。得到樣品中總黃酮百分含量（T）[8]。

1.2.3 抗氧化性的測定

1.2.3.1 雞油菌黃酮類化合物對超氧自由基（O2·-）的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[9]。取0.05 mol/L，pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL加入盛有4.2 mL蒸餾水的試管中，置25℃水浴中預熱20 min。分別加入不同的試樣醇提物溶液0.1 mL，立即加入在25℃水浴中預熱的3 mmol/L鄰苯三酚（由10 mmol/L HCl配制）0.3 mL，混勻后25℃水浴中準確反應4 min，立即加入8 mol/L HCl 2滴終止反應，在420 nm處測定吸光度（樣品管以同濃度的試樣醇提物溶液做參比）。模型組以0.1 mL蒸餾水代替樣品試液（以蒸餾水做參比）。用抗壞血酸（VC）做對照，分別測定五組不同濃度的的樣品液及抗壞血酸的吸光度。臨用前以濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）配置。超氧自由基（O2·-）按以下公式計算清除率。

1.2.3.2 雞油菌黃酮類化合物對羥基自由基（·OH）的清除作用

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定Fe2+/H2O2體系中產生的·OH自由基[10]。依次加入鄰二氮菲1.5 mL，pH7.4的PBS溶液3.8 mL及試樣總黃酮溶液1 mL（損傷管及未損傷管不加試樣總黃酮溶液）混勻，再加FeSO4溶液1.5 mL，立即混勻，最后加H2O21 mL（未損傷管不加）。最終濃度鄰二氮菲0.75mmol/L、FeSO40.75mmol/L、H2O20.01%,總體積9 mL（不足用蒸餾水補足）。各管置37℃恒溫水浴箱保溫60 min，分別測定各管A536值（樣品管以同濃度的試樣總黃酮溶液做參比，損傷管及未損傷管以蒸餾水做參比）。用抗壞血酸（VC）做對照，分別測定五組不同濃度的樣品液及抗壞血酸的吸光度。臨用前以蒸餾水配置。（·OH）自由基按以下公式計算清除率。

1.2.3.3 雞油菌黃酮類化合物對亞硝酸鹽清除率的測定

取已知濃度的提取液2 mL于25 mL容量瓶，加入5 μg/mL的NaNO2標準溶液3 mL，加入檸檬酸－磷酸緩沖溶液（pH＝3.0）5 mL，37℃下反應 15 min，立即加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3 min～5 min后，加入1 mL 0.2%鹽酸萘已二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，以5 mL提取液為空白，在540 nm處測吸光度。用用抗壞血酸（VC）做對照，分別測定五組不同濃度的的樣品液及抗壞血酸的吸光度[11-12]。按下式計算NO2－的清除率。

式中：A0為NO2－的溶液吸光度；A為樣品組的吸光度。

2 實驗結果

2.1 總黃酮含量的測定

根據1.2.2可得出雞油菌中總黃酮含量為0.68%，從而可得提取液中黃酮含量為0.204 1 g/L。

2.2 抗氧化性的研究

2.2.1 對超氧自由基（O2·-）的清除作用

根據方法1.2.3.1，配制五種不同濃度的樣品溶液，測定其吸光度，并計算其對O2·-的清除率，以抗壞血酸為對照，同法測定其吸光度，并計算其對O2·-的清除率，見圖2和圖3。

2.2.2 對羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2 總黃酮對超氧自由基的清除率Fig.2 O2-·radical scavenging rate of total flavonoids

圖3 抗壞血酸對超氧自由基的清除率Fig.3 O2·-radical scavenging rate of VC

根據方法1.2.3.2，配制5種不同濃度的樣品溶液，測定其吸光度，并計算其對·OH的清除率，以抗壞血酸為對照，同法測定其吸光度，并計算其對·OH的清除率，見圖4和圖5。

圖4 總黃酮對羥自由基的清除率Fig.4 ·OH radical scavenging rate of total flavonoids

2.2.3 對亞硝酸鹽（NO2-）清除率的測定

根據方法1.2.3.3，配制5種不同濃度的樣品溶液，測定其吸光度，并計算其對NO2-的清除率，以抗壞血酸為對照，同法測定其吸光度，并計算其對NO2-的清除率，見圖6和圖7。

由以上各圖可得當總黃酮濃度為0.204 1 mg/mL時，對超氧陰離子的清除率為44.2%，羥基自由基的清除率為11.4%，亞硝酸根的清除率為50%。

圖5 抗壞血酸對羥自由基的清除率Fig.5 ·OH radical scavenging rate of VC

圖6 總黃酮對亞硝酸鹽的清除率Fig.6 NO2-scavenging rate of total flavonoids

圖7 抗壞血酸對亞硝酸鹽的清除率Fig.7 NO2-scavenging rate of VC

3 結論

由實驗可得當總黃酮濃度為0.204 1 g/L時，對超氧陰離子的清除率為44.2%，羥基自由基的清除率為11.4%，亞硝酸根的清除率為50%。雞油菌總黃酮能有效的清除超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）。其質量濃度與對超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用成正相關系，雖然其清除率小于VC對超氧自由基、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用但通過對雞油菌黃酮清除自由基能力的測定，確定其具有較強的清除超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的能力，從而確定了雞油菌黃酮具有抗氧化能力，可將其作為抗氧化劑應用到食品和藥品行業中，這也將為進一步的促進天然抗氧化劑的研究與開發起到一定的積極作用。

[1] 廖顯輝,楊燕紅.食用菌類保健食品的開發探討[J].農業科技,2008,11(7):241-242

[2] 上官周建,吳鶴群.食用菌抗氧化物的活性與應用研究[J].中國食用菌,1999(3):12-13

[3] 殷蔚申.食品微生物學[M].北京:中國財政經濟出版社,1991:241-249

[4] 李張偉,劉宇輝,張珠珠.橄欖黃酮的提取及其抗氧化作用的研究[J].廣東化工,2007,34(12):37-40

[5] 陳季武,胡天喜,朱振勤.銀杏葉黃酮抗氧化作用的研究[J].華東師范大學學報:自然科學版,1998,3(1):88-90

[6] 張海生,陳錦屏.蜂蛹黃酮的提取及體外抗氧化作用的研究[J].食品科學,2008(2):158-162

[7] 項昭保,任紹光,石軼松,等.吸光光度計法測定蕎麥秸中總黃酮含量[J].理化檢驗—化學分冊,2002,38(9):436-437

[8] 葉菊,蘇印泉,呂建榮,等.羅布麻總黃酮含量的研究[J].西北林學院學報,2006,21(3):114-115

[9] 張曉強,浦躍樸,尹立紅,等.冬蟲夏草及人工蟲草菌絲體對超氧陰離子自由基和羥自由基清除作用的實驗研究[J].中國老年學雜志,2003,23(11):773-775

[10]金鳴,蔡亞欣,李金榮,等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基[J].生物化學與生物物理進展,1996,23(6):553-555

[11]沈莞梅,靳學遠.石榴葉總黃酮抗氧化性的研究[J].安徽農學通報,2008,14(21):63-64

[12]薛長暉,王佩維,姚晨之.苦蕎粉提取液對NO2-清除作用的體外試驗研究[J].糧油加工與食品機械,2002(10):48