細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質細胞水通道蛋白和內向整流性鉀通道4.1基因表達的影響①

杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質細胞水通道蛋白和內向整流性鉀通道4.1基因表達的影響①

杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

目的探討不同濃度細胞松弛素D(CytD)對大鼠脊髓星形膠質細胞骨架重構，水通道蛋白(AQP)1、AQP4及內向整流性鉀通道4.1(Kir4.1)基因表達的影響。方法原代培養大鼠脊髓星形膠質細胞，加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml和1.00 μg/ml共培養2 h、12 h和24 h。MTT法檢測細胞增殖情況；鬼筆環肽聯合Hoechst 33342套染后激光共聚焦顯微鏡下觀察共培養2 h后細胞骨架重構情況；RT-PCR法檢測共培養2 h時AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達水平。結果細胞生存率隨CytD濃度升高和作用時間延長而減少。CytD使大鼠脊髓星形膠質細胞微絲發生解聚、彎曲，但極性未失。CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml上調AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達。結論適當濃度CytD可以重建星形膠質細胞骨架，上調大鼠脊髓星形膠質細胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表達。

星形膠質細胞；細胞松弛素；細胞骨架；水通道蛋白；內向整流性鉀通道；脊髓；大鼠

[本文著錄格式] 杜文佳，汪玉良，黨躍修，等.細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質細胞水通道蛋白和內向整流性鉀通道4.1基因表達的影響基因表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(7):616-620.

星形膠質細胞在中樞神經系統中具有免疫調節、維持神經元微環境相對穩定和調節突觸信號傳遞等作用[1-4]。中樞神經系統損傷后，膠質細胞產生應激反應，發生水腫，導致細胞骨架重構，進而影響細胞物質運輸、基因表達和信號傳遞等生命過程。水通道蛋白(aquaporin,AQPs)是星形膠質細胞中一組參與跨細胞水轉運的膜通道蛋白，它們不僅在維持顱內滲透壓及水電解質平衡中發揮著重要作用，同時也參與腦缺血、腦腫瘤和顱內感染等誘發的腦水腫病理過程。本研究采用細胞松弛素D(cytochalasin D,CytD)對體外培養大鼠脊髓星形膠質細胞重構其細胞骨架系統，研究不同濃度CytD作用下，星形膠質細胞形態學、微絲系統的改變及AQP1、AQP4和內向整流性鉀通道4.1(inward rectifying potassium channel 4.1,Kir4.1)基因表達的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級新生2～3 d Sprague-Dawley大鼠，由甘肅中醫學院動物實驗中心提供(動物質量合格證號：SCXK甘2004-0006-152)。

1.2 主要儀器與試劑

DMEM/F12培養液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和胰蛋白酶：GIBCO公司。青霉素、鏈霉素：華北制藥股份有限公司。阿糖胞苷：上海華聯制藥有限公司。CytD、多聚賴氨酸和Triton X-100：SIGMA公司。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔多克隆抗體：PROTEINTECH GROUP公司。羊抗兔IgG-FITC：北京中杉公司。Trizol、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒：INVITROGEN公司。激光共聚焦顯微鏡：OLYMPUS公司。實時定量PCR儀：BIORAD公司。二氧化碳培養箱：SANYO公司。

1.3 星形膠質細胞的培養

新生Sprague-Dawley大鼠10只，75%酒精浸泡5 min后移至超凈工作臺，無菌條件下分離脊髓組織；DMEM培養液清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，完全培養液終止消化。反復吹打后，1500 r/min離心10 min，棄上清。200目篩網過濾后加入DMEM-F12培養基(含10%FBS)，加入完全培養基，重懸細胞，將其接種至25 cm2培養瓶中，差速貼壁。將細胞轉移至5%CO2培養箱中，37℃培養48 h后換液。以后每隔3 d換液1次，待細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，傳代培養。

1.4 星形膠質細胞的鑒定

取P2代細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔板，培養12 h。棄培養液，PBS清洗2次，加預冷甲醛200 μl，37℃固定20 min；PBS清洗3次，加入PBS-T 200 μl，4℃10 min后移除PBS-T，PBS清洗5 min；加入PBS-B 200 μl，37℃30 min。加入GFAP一抗100 μl，4℃過夜，PBS清洗5 min；加羊抗兔FITC標記二抗150 μl，37℃ 1 h；PBS洗3次，每次5 min。封片，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，熒光顯微鏡下檢測GFAP表達并拍照。

1.5 MTT檢測

P2代星形膠質細胞以3×103/ml接種于96孔板。培養24 h后，分別換入含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml、1.00 μg/ml完全培養液，空白對照組正常換液。培養2 h、12 h和24 h后棄去上清液，每孔加入無血清DMEM/ F12培養液100μl、0.5%MTT 10μl、DMSO 100μl，振蕩10 min，酶標儀570 nm波長檢測吸光度(OD)。

1.6 激光共聚焦顯微觀察

P2代星形膠質細胞以每孔5×105接種于24孔板內進行細胞爬片，分別換含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.8 μg/ml的完全培養基，空白對照孔正常換液。繼續培養2 h后棄培養液，PBS清洗3次，每孔加入4%多聚甲醛1 ml，室溫固定20 min。10 μg/ml鬼筆環肽37℃染色1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入10 μg/ml Hoechst 33342室溫染色15 min，PBS洗3次。抗熒光淬滅封片劑封片，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 RT-PCR

按照Trizol說明書提取空白對照組以及各濃度CytD培養2 h后星形膠質細胞總RNA，A260、A280檢測提取純度及濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取1 μg總RNA為模板，以寡核苷酸(Oligo dT)為引物，按逆轉錄試劑盒說明書進行操作，所得cDNA-20℃保存。逆轉錄反應結束后，用RT-PCR試劑盒進行擴增與定量反應，引物序列見表1，反應體系50 μl，擴增條件為50℃ 2 min，95℃預變性2 min后，95℃ 15 s、61.2℃ 35 s，共45個循環，每次延伸結束后讀板，采用2-ΔΔCt法對基因表達進行定量分析，所有實驗重復3次。

表1 引物序列表

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 星形膠質細胞的培養及鑒定

P2細胞GFAP陽性率＞95%。倒置相差顯微鏡觀察：GFAP陽性細胞胞體較大，有短而粗大的突起，形態不規則，輪廓較清晰(圖1)。

2.2 MTT

培養2 h后，與空白對照組比較，CytD各濃度組細胞的存活率均有所下降，且0.80 μg/ml和1.00 μg/ml組有顯著性差異(P＜0.05)；培養12 h、24 h后，CytD各濃度組細胞存活率進一步下降，與空白對照組均存在顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.3 細胞骨架

倒置相差顯微鏡下觀察，空白對照組細胞胞體較大，呈星形或多角形，胞突較多較長，胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側。CytD各濃度組細胞體積增大，形狀不規則，胞突數量增多，細胞間緊密連接變少，胞核區域不明顯。見圖2。

激光共聚焦顯微觀察，空白對照組細胞微絲骨架排布呈明顯極性，分布均勻，微絲筆直；Cyt D可使星形膠質細胞微絲骨架發生解聚并彎曲，呈片狀，但未喪失排布極性。見圖3。

2.4 RT-PCR

與空白對照組比較，Cyt D 0.05 μg/ml、0.10 μg/ ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml濃度組AQP1表達量上調(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；AQP4表達上調(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；Kir4.1表達上調(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表2 各組細胞生存率比較

表3 各組細胞AQP1、AQP4和Kir4.1表達比較

圖1 細胞培養與鑒定(100×)

圖2 各組細胞培養2 h形態(倒置相差顯微鏡，400×)

圖3 各組細胞培養2 h形態(激光共聚焦顯微鏡，400×)

3 討論

細胞骨架是真核細胞中的蛋白網架系統[7]。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質骨架、細胞膜骨架和細胞外基質，形成貫穿于細胞核和細胞質的網架體系[8]；通常所稱的狹義細胞骨架是指細胞質骨架，由微絲、微管和中間纖維構成[9]。細胞骨架能維持細胞的正常形態，但并非靜止的支架系統，而是一個組裝與去組裝動態平衡的網絡，并發揮著多種生物學功能[10]。

CytD是公認的能夠破壞細胞微絲的藥物[11]。我們采用CytD對大鼠脊髓星形膠質細胞的微絲系統進行干預。我們的研究證實，CytD對星形膠質細胞體外增殖有一定抑制作用，但0.05～0.40 μg/ml濃度共培養2 h，細胞生存率＞90%，與空白對照組無顯著性差異。

相差顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察，CytD可使星形膠質細胞體積增大，偽足增長，胞突數量增多，細胞間緊密連接喪失；細胞骨架解聚。已有研究報道，星形膠質細胞緊密連接的破壞，可能與臨床腦外傷后血腦屏障破壞產生廣泛的腦水腫有關[12]。我們推測，星形膠質細胞水腫可能與細胞骨架解聚存在著一定關系。

在中樞神經系統中分布著幾種AQPs，其中研究較多的有AQP1、AQP4和AQP9。有研究顯示，AQP1和AQP4是中樞神經系統最主要的AQPs，與腦脊液的形成存在密切聯系；由于分布位置的特殊性，AQP4在腦水腫顱內水平衡調節上可能發揮著重要作用[13-15]。

AQP1和AQP4與脊髓損傷后水腫的形成也關系密切。有研究表明，星形膠質細胞膜上AQP4和Kir4.1在某些膠質細胞特殊膜域有密切的共同表達，推測AQP4介導的水分子轉運可能與Kir4.1調節K+跨膜轉運作用相偶聯[16-17]。關于細胞骨架與膜蛋白之間的關系，目前研究較多的是細胞骨架與心肌快鈉內流(INa)的關系。已有研究表明，細胞骨架的重構與心肌細胞膜蛋白功能存在密切聯系[18]。星形膠質細胞與細胞骨架之間的關系鮮有報道。

本研究中RT-PCR結果顯示，CytD可以上調AQP1、AQP 4和Kir4.1 mRNA的表達水平，推測星形膠質細胞骨架對與水腫相關的離子通道及膜蛋白具有調節作用，細胞骨架解聚可能導致細胞水腫發生。

本文通過CytD重構星形膠質細胞的細胞骨架，應用形態學及RT-PCR等方法檢測星形膠質細胞水通道蛋白以及K+通道基因表達水平。結果提示，應用CytD后，星形膠質細胞骨架發生解聚，AQPs、Kir4.1表達水平上調；不同濃度CytD對AQPs、Kir4.1表達的調控可在2 h內實現，并存在量效關系。我們推測，微絲解聚可能會引起細胞水腫，其機制可能與上調水腫相關基因表達有關。這些為臨床治療脊髓損傷、脊髓水腫提供了基礎實驗資料。

為了進一步研究細胞骨架解聚與細胞水腫的關系，還需進一步進行體內實驗。

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Effects of Cytochalasin D on Expression of Aquaporins and Inward Rectifying Potassium Channel 4.1 Gene in Spinal Cord Astrocytes of Rats

DU Wen-jia,WANG Yu-liang,DANG Yue-xiu,et al.Department of Orthopedics,The Second Hospital of Lanzhou University, Orthopaedics Key Laboratory of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin(AQP)1,AQP4,inward rectifying potassium channel 4.1(Kir4.1)and cytoskeleton features of rat spinal cord astrocytes after cytochalasin D(CytD)intervention.MethodsSpinal cord astrocytes isolated from 2～3-day-old rats were cultured till confluency.MTT was used to assess survival rate of astrocytes 2 h,12 h and 24 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD,respectively.Confocal microscopy was used to observe cytoskeleton features of astrocytes 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml of CytD.The expression of AQP1, AQP4,Kir4.1 mRNA were determined with real-time PCR 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD.ResultsThe survival rate of rat spinal cord astrocytes reduced with the time of co-culture and concentration of CytD(P＜0.05).The cytoskeleton of astrocytes was reconstructed.The expression of AQP1,AQP4 and Kir4.1 mRNA increased after co-cultured with 0.05～0.40 μg/ml of CytD.ConclusionThe appropriate dosage of CytD may remodel the cytoskeleton and increase the mRNAexpression ofAQP1,AQP4 and Kir4.1 in spinal cord astrocytes of rats.

astrocyte;cytochalasin;cytoskeleton;aquaporin;inward rectifying potassium channel;spinal cord;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.07.003

R651.2

A

1006-9771(2014)07-0616-05

2013-10-22

2013-11-27)

1.甘肅省技術研究與開發專項計劃項目(No.1004TCYA028)；2.蘭州大學第二醫院2010年度院內科研項目(No.YJ2010-48)。

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節病重點實驗室，甘肅蘭州市730030。作者簡介：杜文佳(1980-)，男，甘肅山丹縣人，碩士研究生，主要研究方向：脊髓損傷與骨腫瘤。通訊作者：汪玉良，男，主任醫師，碩士研究生導師。