側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)注射神經(jīng)肽S對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛及焦慮行為的影響①

金旭，曾敏，熊蔚，羅芳

側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)注射神經(jīng)肽S對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛及焦慮行為的影響①

金旭，曾敏，熊蔚，羅芳

目的研究側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)注射神經(jīng)肽S對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為及焦慮行為的影響，探討神經(jīng)肽S對(duì)疼痛和焦慮影響的作用機(jī)制。方法40只雄性Sprague-Dawley大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham-Veh組)、假手術(shù)神經(jīng)肽S組(Sham-NPS組)、慢性壓迫性神經(jīng)損傷組(CCI組)、神經(jīng)肽S低劑量組(NPSl組，0.1 nmol/L)和神經(jīng)肽S高劑量組(NPSh組，1 nmol/L)，每組8只。制備CCI動(dòng)物模型，造模成功后第7天左側(cè)側(cè)腦室置入微透析用導(dǎo)針，自術(shù)后第8天起每日側(cè)腦室注射相應(yīng)藥物，在術(shù)后第14天檢測(cè)機(jī)械痛縮足閾值和熱輻射縮足潛伏期，并通過(guò)高架十字迷宮檢測(cè)焦慮行為的變化。采用免疫組織熒光技術(shù)檢測(cè)左側(cè)杏仁核區(qū)神經(jīng)肽S受體(NPSR)的表達(dá)。結(jié)果與Sham-Veh組比較，CCI組大鼠術(shù)后14 d出現(xiàn)明顯疼痛和焦慮行為(P＜0.01)，NPSh組明顯緩解(P＜0.01)，NPSl組與CCI組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。免疫組織熒光結(jié)果顯示，與CCI組相比，NPSh組杏仁核區(qū)NPSR表達(dá)明顯增加。結(jié)論神經(jīng)肽S可以劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)CCI大鼠的疼痛和焦慮行為，其機(jī)制可能與杏仁核NPSR上調(diào)有關(guān)。

神經(jīng)病理性疼痛；神經(jīng)肽S；焦慮；側(cè)腦室注射；杏仁核；大鼠

[本文著錄格式] 金旭，曾敏，熊蔚，等.側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)注射神經(jīng)肽S對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛及焦慮行為的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(7):621-625.

疼痛是一種多維度概念，不僅包括感覺(jué)分辨，尤其是慢性疼痛，一定或多或少存在情感體驗(yàn)成分，另外還可能包含認(rèn)知評(píng)價(jià)的維度；而且在慢性痛患者中，其相關(guān)的情感體驗(yàn)一定是負(fù)面的占主導(dǎo)因素。目前尚不明了，是負(fù)面情感因素加重了慢性疼痛，還是慢性疼痛惡化了負(fù)面精神疾病。因其復(fù)雜的混雜，臨床常表現(xiàn)為共病[1-2]，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的機(jī)制研究上一定會(huì)表現(xiàn)為交叉影響。因此，尋找二者之間的橋梁成為弄清楚共病的關(guān)鍵所在。臨床研究表明，焦慮和慢性疼痛有較高相關(guān)性，而且影響較抑郁深遠(yuǎn)。焦慮與疼痛都與精神覺(jué)醒狀態(tài)有關(guān)，是機(jī)體保護(hù)性機(jī)制之一，可能存在著共同的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[3-4]，至少二者的神經(jīng)傳導(dǎo)通路存在著諸多的相互影響。

長(zhǎng)期以來(lái)，抗精神病藥物，尤其是抗抑郁藥和抗癲癇藥在神經(jīng)病理性疼痛治療中占有重要地位，但沒(méi)有證據(jù)表明，抗焦慮藥對(duì)慢性疼痛有效。

神經(jīng)肽S(neuropeptide S,NPS)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽。NPS及其受體(NPSR)的廣泛分布，表明其功能絕不單一。目前研究表明，NPS在調(diào)節(jié)覺(jué)醒與睡眠、抗焦慮、調(diào)節(jié)攝食和能量代謝、免疫調(diào)節(jié)以及學(xué)習(xí)和記憶等諸多方面都有作用。其抗焦慮作用明確[5]，而且有研究表明可能有鎮(zhèn)痛作用[6]，這就可能構(gòu)成抗焦慮和鎮(zhèn)痛的雙重特性。本研究擬通過(guò)腦室內(nèi)連續(xù)給藥研究NPS對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛行為和焦慮行為的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham-Veh組)、假手術(shù)神經(jīng)肽S組(Sham-NPS組)、慢性壓迫性神經(jīng)損傷(chronic constriction injury,CCI)組、神經(jīng)肽S低劑量組(NPSl組，0.1 nmol/L)、神經(jīng)肽S高劑量組(NPSh組，1 nmol/L)，每組8只。

1.2 藥物、試劑和儀器

神經(jīng)肽S：SIGMA-ALDRICH公司，美國(guó)。兔抗大鼠NPSR抗體一抗、小鼠抗大鼠NeuN一抗、羅丹明-山羊抗小鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗兔IgG：ABCAM公司，美國(guó)。含DAPI的封片劑：SIGMA-ALDRICH公司，美國(guó)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。von Frey纖毛機(jī)械刺激儀：NORTH COAST MEDICAL公司，美國(guó)。輻射熱痛儀：UGO BASILE公司，意大利。倒置熒光顯微鏡：LEICA公司，德國(guó)。Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)：MEDIA CYBERNETICS公司，美國(guó)。

1.3 造模及側(cè)腦室置管

室溫維持在20～23℃，濕度49%～51%，光照明∶暗＝12 h∶12 h。自由飲水?dāng)z食，隔天更換墊料。按Bennett等[7]方法制作CCI模型，各組大鼠均選擇右下肢為手術(shù)側(cè)。暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位，游離神經(jīng)約7 mm，用4-0號(hào)羊腸線將坐骨神經(jīng)結(jié)扎4道，相隔1 mm，影響神經(jīng)4～5 mm。止血、抗炎、縫合皮膚。

CCI造模成功后第7天進(jìn)行側(cè)腦室置管。大鼠稱重后腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭頂局部常規(guī)備皮、消毒，頭頂正中矢狀切開(kāi)約1.5 cm，3%H2O2棉球擦拭使前囟暴露清晰。確定前后囟在同一水平線上后，于前囟后0.8 mm矢線左側(cè)1.5 mm處用手鉆鉆一孔，置入微透析用導(dǎo)針，并用牙托粉及膠水妥善固定，待動(dòng)物清醒后無(wú)任何不適(出血、偏癱等)1 d后(即CCI后8天起)連續(xù)注射相應(yīng)藥物7 d。

1.4 給藥方法

Sham-Veh組大鼠除未進(jìn)行坐骨神經(jīng)壓榨外，其他操作均與CCI組一致。Sham-Veh組和CCI組大鼠分別在術(shù)后第8～14天每天側(cè)腦室注射1次人工腦脊液(artificial cerebral spinal fluid,ACSF)20 μl；而NPSl組在相同時(shí)間點(diǎn)分別側(cè)腦室注射1次NPS 0.1 nmol/L(10 μl)，NPSh組和Sham-NPS組則在相同時(shí)間點(diǎn)注射NPS 1 nmol/L(10 μl)，每次注藥后經(jīng)導(dǎo)管注射ACSF 10 μl沖洗導(dǎo)管。

1.5 疼痛行為學(xué)測(cè)定

用von Frey纖維細(xì)絲法測(cè)定大鼠的機(jī)械痛縮足閾值，記錄von Frey纖維絲刺激大鼠足底10次中能引起5次以上縮足的最小von Frey纖維絲質(zhì)量為其機(jī)械痛閾值，最高閾值設(shè)為26 g，如果高于26 g仍然無(wú)反應(yīng)，則記錄為26 g。術(shù)后5 d選擇痛閾明顯降低者為造模成功者，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。用熱輻射照射大鼠后肢足底外側(cè)，記錄熱輻射縮足反射潛伏期。

1.6 焦慮行為學(xué)測(cè)定

采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze,EPM)進(jìn)行測(cè)定。高架十字迷宮開(kāi)放臂50×10 cm、閉合臂50×10×20 cm、中央?yún)^(qū)10×10 cm，相同類型的臂通過(guò)中央?yún)^(qū)相對(duì)連接。整個(gè)儀器置于距離地面50 cm的位置。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)面對(duì)閉合臂置于中央?yún)^(qū)位置，并使動(dòng)物自由探索5 min。記錄：①動(dòng)物運(yùn)動(dòng)總距離；②進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)；③在開(kāi)放臂停留時(shí)間占比(動(dòng)物的四肢全部進(jìn)入一個(gè)臂內(nèi)方可認(rèn)為有效)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用10%乙醇進(jìn)行清洗實(shí)驗(yàn)儀器以消除動(dòng)物氣味的干擾。

1.7 免疫熒光法測(cè)定對(duì)側(cè)腦杏仁核區(qū)NPSR的表達(dá)

行為學(xué)測(cè)試后動(dòng)物在水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉下，心臟插管灌流固定，取鼠腦組織置于40 g/ L多聚甲醛液中固定1.5 h，再用300 g/L蔗糖脫水，OCT膠包埋，20 μm連續(xù)冰凍切片，顯微鏡下選取含左側(cè)杏仁核區(qū)。切片用含有0.3%Triton×100的5%牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)室溫封閉1 h，加入兔抗大鼠NPSR一抗(1∶200)和小鼠抗大鼠NeuN一抗(1∶500)在4℃孵育過(guò)夜。用不加一抗的孵育液做對(duì)照。然后用帶熒光羅丹明和FITC的二抗孵育。脫水，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用(±s)表示。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 疼痛行為

與Sham-Veh組相比，CCI組大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾在造模14 d時(shí)明顯下降(P＜0.01)。與CCI組相比，NPSh組大鼠14 d時(shí)機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯上升(P＜0.01)；NPSl組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾改變均不明顯(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

Sham-Veh組和Sham-NPS組的機(jī)械痛縮足閾值和熱輻射縮足潛伏期均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 焦慮行為

側(cè)腦室置管8 d時(shí)和CCI術(shù)后14 d時(shí)，大鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的總運(yùn)動(dòng)距離沒(méi)有明顯影響。與Sham-Veh組相比，CCI組進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間和次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。與CCI組比較，NPSh組進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間和次數(shù)增加(P＜0.01)，NPSl組則無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)側(cè)杏仁核NPSR表達(dá)的變化

免疫熒光結(jié)果顯示，CCI組左側(cè)腦杏仁核區(qū)NPSR較少表達(dá)，NPSh組NPSR表達(dá)明顯增加。見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠痛行為學(xué)測(cè)試

表2 各組大鼠焦慮行為學(xué)測(cè)試

圖1 側(cè)腦室給予高劑量NPS對(duì)Sham-Veh組痛行為的影響

3 討論

有臨床證據(jù)表明，慢性疼痛尤其是神經(jīng)病理性疼痛與焦慮有較高的相關(guān)性，而且越來(lái)越多的研究注意到慢性疼痛患者的焦慮癥狀不但多于抑郁癥狀，而且其影響也更深遠(yuǎn)[2,8-9]。fMRI研究也發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛和焦慮有著相同的腦活動(dòng)增強(qiáng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠在第14天出現(xiàn)明顯焦慮行為。一般認(rèn)為，疼痛引發(fā)焦慮，焦慮加重疼痛，形成惡性循環(huán)[10]。理論上，如能從內(nèi)部打破這一惡性循環(huán)，對(duì)神經(jīng)病理性疼痛一定有益。

杏仁核是位于大腦海馬末端的一個(gè)皮層下核團(tuán)，當(dāng)外界刺激經(jīng)過(guò)皮層和海馬等一系列核團(tuán)后，到達(dá)杏仁核，在杏仁核里經(jīng)過(guò)信息的整合，再由杏仁基底外側(cè)核區(qū)或杏仁外側(cè)核區(qū)傳遞到中央核區(qū)，中央核區(qū)再投射到腦干皮層等區(qū)域，通常認(rèn)為杏仁核與其他核團(tuán)之間的這種聯(lián)系與焦慮形成有關(guān)[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn)，NPS前體mRNA和NPSR在多種組織表達(dá)，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)多部位高表達(dá)，其他組織分布相對(duì)較少，而且與應(yīng)激和焦慮相關(guān)的腦區(qū)，如杏仁核、下丘腦、中縫核群和腹側(cè)被蓋區(qū)和疼痛調(diào)節(jié)的下行控制系統(tǒng)的腦區(qū)[13-14]，如中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫核和側(cè)臂旁核等二者都有較高水平的表達(dá)[15]。

圖2 對(duì)側(cè)杏仁核NPSR表達(dá)的變化(熒光顯微鏡，200×)

NPS抗焦慮作用明確[16]，且有一定的鎮(zhèn)痛作用[17]。本研究旨在探討NPS側(cè)腦室給藥對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響，旨在揭示慢性疼痛與焦慮的關(guān)系。慢性疼痛-焦慮共病是一個(gè)惡性循環(huán)，此惡性循環(huán)可能有不同神經(jīng)通路和不同腦區(qū)作用，也可能有共同的神經(jīng)通路和作用腦區(qū)，或存在交互作用。NPS和NPSR通路在疼痛和焦慮二者之間都有作用，可能是慢性疼痛和焦慮的樞紐。杏仁核可能是NPS-NPSR作用的最關(guān)鍵腦區(qū)/核團(tuán)。在CCI大鼠慢性疼痛和焦慮共病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴隨著NPSR的明顯下調(diào)；補(bǔ)充NPS焦慮和疼痛均有改善，NPSR表達(dá)明顯增加。

當(dāng)然，NPS-NPSR系統(tǒng)并不是單獨(dú)作用，而是作為共神經(jīng)遞質(zhì)起到調(diào)節(jié)作用[18]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NPSR和谷氨酸脫羧酶(GAD67)在杏仁核神經(jīng)細(xì)胞共表達(dá)；有電生理證據(jù)表明，NPS直接激活杏仁內(nèi)側(cè)核區(qū)氨基丁酸(GABA)能中間神經(jīng)元，而起到抗焦慮與鎮(zhèn)痛作用。

本研究也存在缺陷。①疼痛和焦慮是較為復(fù)雜的精神情緒問(wèn)題，影響因素極多，在動(dòng)物身上測(cè)量一直飽受爭(zhēng)議。本研究?jī)H選用較少的經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)來(lái)測(cè)量疼痛和焦慮，可能在說(shuō)服力上會(huì)有影響。但是一般來(lái)說(shuō)，機(jī)械痛和熱痛的測(cè)量基本可以涵蓋疼痛，而EPM實(shí)驗(yàn)是焦慮測(cè)量敏感而準(zhǔn)確的指標(biāo)之一。這幾個(gè)指標(biāo)是研究疼痛和焦慮行為必備和最重要的指標(biāo)，代表性好。②免疫熒光化學(xué)提出的證據(jù)稍顯粗糙，也沒(méi)有更多的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)支持，是今后進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，側(cè)腦室連續(xù)注射高劑量NPS可以有效抑制CCI大鼠焦慮和疼痛行為，其機(jī)制可能與對(duì)側(cè)杏仁核區(qū)NPSR上調(diào)有關(guān)。

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Effect of Intracerebroventricular Injection of Neuropeptide S on Pain and Anxiety Behaviors in Rats with Neuropathic Pain

JIN Xu,ZENG Min,XIONG Wei,et al.Department of Anesthesia and Pain Therapy,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

ObjectiveTo investigate the effects of intracerebroventricular injection of neuropeptide S(NPS)on pain and anxiety behaviors in rats with neuropathic pain,and explore the possible mechanism.Methods40 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into Sham-Vehicle group,Sham-NPS group,chronic constriction injury(CCI)group,Neuropeptide S low-dose group(NPSl group,0.1 nmol/L) and Neuropeptide S high-dose group(NPSh group,1 nmol/L),with 8 rats in each group.Pain-related behaviors,anxiety-related behaviours, and expression of NPS receptor(NPSR)in the left amygdaloid nucleus were measured on the 14th day via intracerebroventricular injection.ResultsCompared with the Sham-Vehicle group,the CCI group demonstrated significant pain and anxiety behaviors 14 days after operation (P＜0.01),the NPSh group significantly relieved(P＜0.01).And there was no significant difference between the NPSl group and the CCI group(P＞0.05).Compared with the CCI group,NPSR expression in amygdaloid nucleus increased in the NPSh group.ConclusionNPS can dose-dependently relieve the pain and anxiety behaviors in CCI rats,which may be related with the increase of NPSR in amygdaloid nucleus.

neuropathic pain;neuropeptide S;anxiety;intracerebroventricular injection;amygdaloid nucleus;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.07.004

R741

A

1006-9771(2014)07-0621-05

2014-03-14

2014-04-11)

1.北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(學(xué)科骨干)項(xiàng)目(No.2013-3-047)；2.天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題項(xiàng)目(No.2013-1-008)。

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院麻醉科，北京市100050。作者簡(jiǎn)介：金旭(1974-)，男，遼寧大連市人，博士后，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向：慢性疼痛的基礎(chǔ)與臨床研究。