成年大鼠心肌細胞分離培養及興奮-收縮耦聯表征

孫 敏，于海奕，張幼怡，呂志珍，高 煒，李子健

（北京大學第三醫院心內科血管醫學研究所，衛生部心血管分子生物學與調節肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京 100191）

成年大鼠心肌細胞分離培養及興奮-收縮耦聯表征

孫 敏，于海奕，張幼怡，呂志珍，高 煒，李子健

（北京大學第三醫院心內科血管醫學研究所，衛生部心血管分子生物學與調節肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京 100191）

目的 比較兩種細胞分離液分離成年大鼠心肌細胞，進一步表征成年大鼠心室肌細胞興奮-收縮耦聯。方法 Langendorff裝置進行主動脈逆流灌流，分別用兩種細胞分離液分離成年大鼠心肌細胞，無血清培養并進行腺病毒感染。顯微鏡下觀察單個心肌細胞的形態學特點，熒光顯微鏡下檢測病毒感染。采用IonOptix儀器檢測心肌細胞肌節收縮-舒張指標以及心肌細胞鈣離子攝入-排出指標。結果 兩種分離液均可獲得70％橫紋清晰的長桿狀心肌細胞，培養可存活7 d以上。腺病毒感染48 h，綠色熒光蛋白持續表達7 d以上。分離液一獲得的心肌細胞不能很好地隨電場刺激產生收縮，分離液二獲得的細胞可用于檢測興奮-收縮耦聯特性，心肌細胞肌節縮短分數為11.61％±2.15％，舒張時間為（0.177±0.031）s，鈣瞬變幅度為30.79％ ±9.74％，鈣瞬變衰減時間為（0.300±0.074）s。結論 兩種分離液均可用于分離和培養成年大鼠心肌細胞，并用于腺病毒轉染等長時程研究。分離液二更適用于檢測成年大鼠心肌細胞的興奮-收縮耦聯特性。

心肌細胞；成年大鼠；分離；培養；興奮-收縮耦聯

目前，心肌細胞是心臟疾病研究主要應用的細胞模型，乳鼠心肌細胞分離和培養的技術方法非常成熟并被廣泛接受。但是乳鼠心肌細胞與成體心肌細胞相比，其結構和功能都存在極大的差異，尤其是利用乳鼠心肌細胞培養來研究心肌細胞電生理存在著很大的局限性，因此人們開始探索成體心肌細胞的分離培養。

自1976年Powell T和Twist VW［1］首次建立了單個成年心肌細胞分離方法后，成年心肌細胞被廣泛地用于心肌細胞興奮-收縮耦聯、鈣信號變化、力學特性、藥物干預、基因治療等研究中［2］。但成熟心肌細胞分離和培養的技術、條件要求較高，使得成熟心肌細胞的分離培養成功率極低。酶解法用于成年大鼠的心肌細胞分離已有近40年的歷史，但至今仍無統一的細胞產率高、活性好的簡便的方法，進而制約了成年心肌細胞在細胞生物學和分子生物學領域的應用。

為此，本研究通過比較目前常用的兩種成年大鼠心肌細胞分離方法在心肌細胞興奮-收縮耦聯檢測中的應用，擬建立一套細胞產率高、鈣耐受性好的成年大鼠心肌細胞快速分離及培養方法，可進行穩定的腺病毒感染，并對成年大鼠心肌細胞的興奮-收縮耦聯進行表征。本研究為深入理解心肌細胞力學特性和相關心血管疾病（如心衰等）提供了基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

6～8周齡SPF級SD雄性大鼠，180～200 g，6只，來源于北京大學醫學部實驗動物中心【生產許可證號：SCXK（京）2012-0001；使用許可證號：SYXK （京）2011-0039】。主要試劑：II型膠原酶、Fura-2、層纖連蛋白（Laminin）：Invitrogen公司；蛋白酶、2，3-丁二酮一肟（BDM）、Medium 199：Sigma公司。

心肌細胞分離液一［3］：200 mL無鈣臺式液：NaCl 1.601 g，KCl 0.081 g，NaH2PO4·2H2O 0.037 g，Glucose·H2O 0.396 g，Taurine 0.250 g，Hepes 0.953 g，MgCl2·6H2O 0.049 g，超純水定容至200 mL，NaOH（2 mol/L）調pH值在7.20～7.30范圍內。酶液I：臺式液15 mL，BSA 15 mg，BDM 15 mg，Taurine 15 mg，膠原酶II8.1mg，蛋白酶1.3 mg。酶液II：臺式液10 mL，BSA 10mg，BDM 10 mg，Taurine 10 mg，膠原酶II 5.4 mg。酶液III：臺式液10 mL，BSA 10 mg，BDM 10 mg，Taurine 10 mg，膠原酶II 5.4 mg。心肌細胞分離液二［4］：200 mL無鈣臺式液：NaCl 1.403 g，KCl 0.082 g，NaH2PO4·2H2O 0.010 g，Glucose·H2O 0.871 g，Taurine 0.248 g，Hepes 1.192 g，MgCl2·6H2O 0.020 g，超純水定容至200 mL，NaOH（2 mol/L）調pH值在7.20～7.30范圍內。酶I：無鈣臺式液35mL，膠原酶II30mg，蛋白酶3 mg，CaCl2（0.2 mol/L）8.75μL。酶II：酶I 15 mL，CaCl2（0.2 mol/L）18.75μL。酶III：酶I15 mL，CaCl2（0.2 mol/L）48.75μL，BSA 30 mg。Buffer A：無鈣臺式液85 mL，EGTA（0.4 mol/L）85 μL。Buffer B：無鈣臺式液80 mL，CaCl2（0.2 mol/L）400μL，BSA 160 mg。所有灌流液需用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，經純氧飽和30 min后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞的分離：取SD大鼠，腹腔注射肝素1000 U/kg，30 min后戊巴比妥鈉腹腔麻醉（50 mg/kg）。參照文獻的方法進行分離［5］，迅速開胸，于主動脈根部處取心臟懸掛。Buffer A灌流3 min，換酶I灌流。酶I灌流完畢換酶II灌流，同時開始酶液循環灌流。至心肌組織變軟時結束消化，將組織剪下置于酶III中，剪碎，酶III消化-離心（500 r/min，1 min）-Buffer B重懸，重復這一過程，直至組織處理完成。用200目濾網過濾去除殘余組織塊，靜置10 min，細胞自然降沉，棄上清，再加入Buffer B液自然降沉。吸棄上清，取10 mL Buffer B液，加入CaCl2（0.2 mol/L）25μL，自然降沉10min。吸棄上清，取10 mL Buffer B液，加入CaCl2（0.2 mol/L）40 μL，自然降沉10 min。使梯度復鈣最終濃度為1.8 mmol/L，置于室溫2 h備用。

1.2.3 大鼠心室肌細胞興奮-收縮耦聯檢測：DMSO溶解Fura-2粉末，終濃度1 mmol/L。取1 mL細胞懸液于EP管內，錫箔紙包裹避光，加入Fura-2溶液1μL。室溫靜置孵育20 min。EP管底部可見小塊沉淀，吸棄上清，加入新鮮臺式液1 mL，混勻。室溫靜置5 min后重復洗滌一次。靜置20 min后上機檢測。使用IonOptix（IonOptixCo，USA）系統檢測心肌細胞興奮-收縮耦聯表征。給予細胞1 Hz，4 ms波寬，幅度15 V的電場刺激。實時采集并記錄心肌細胞肌節收縮-舒張指標以及心肌細胞鈣離子攝入-排出指標。

2 結果

2.1 兩種分離液獲得的心肌細胞形態學觀察

本研究采用的兩種心肌細胞分離液均可分離出單個成年大鼠心肌細胞，且分離出的心肌細胞數量與形態相當。每個大鼠心臟可獲得1×107個細胞，細胞的桿狀率達70％。倒置顯微鏡下可見鈣耐受細胞為長桿狀或矩形，橫紋清晰，排列規則，邊緣銳利，折光性好，大部分為靜息狀態（圖1）。

圖1 兩種分離液獲得成年大鼠心肌細胞的形態Note：A，Themorphological features of cardiomyocytes obtained by the first separation medium；B，Themorphological features of cardiomyocytes obtained by the second separation medium；bar=200μm.Fig.1 Themorphological features of cardiomyocytes obtained by two different separation medium

2.2 心肌細胞培養時間及病毒轉染效率鑒定

將兩種分離液獲得的單個心肌細胞接種到Laminin包被的培養皿中，心肌細胞均能貼壁生長，存活長達14 d（彩插1圖2）。

為進一步驗證獲得的成年大鼠心肌細胞能否用于長時程分子生物學實驗，心肌細胞接種到Laminin包被的培養皿1 h后換液，進行病毒感染。本研究發現，感染攜帶綠色熒光蛋白基因的復制缺陷型腺病毒載體（AdGFP）24 h后可見熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白表達，熒光強度低。感染48 h后綠色熒光蛋白表達率達90％，熒光強度高。培養7 d后仍能檢測到綠色熒光蛋白表達（彩插1圖2）。

2.3 兩種分離液獲得成年大鼠心室肌細胞興奮-收縮耦聯表征的比較

在給予1 Hz，4 ms波寬，幅度15 V的電場刺激下，心肌細胞分離液一分離出的心肌細胞不能隨電刺激的頻率發生節律性收縮，IonOptix儀器記錄的肌節舒縮和鈣信號圖形為圍繞基線產生的噪音信號，表明心肌細胞失去興奮收縮耦聯特性（圖3 A）。心肌細胞分離液二分離出的心肌細胞能夠隨電刺激的頻率發生節律性收縮，IonOptix儀器可實時檢測和記錄成年心肌細胞肌節舒縮和鈣信號圖形（圖3 B）。

統計6只大鼠、15個心肌細胞肌節收縮-舒張指標以及心肌細胞鈣離子攝入-排出指標，反映心室肌細胞興奮-收縮耦聯表征，發現單個成年大鼠心肌細胞肌節縮短分數為11.61％ ±2.15％，舒張時間為（0.177±0.031）s，鈣瞬變幅度為 30.79％ ± 9.74％，鈣瞬變衰減時間為（0.300±0.074）s。

3 討論

目前，成年心肌細胞的分離主要為Langendorff逆行主動脈生物酶灌流消化方法。不同實驗室采用的分離液不盡相同，且分離出的細胞是否適合興奮-收縮耦聯特性的檢測尚無統一標準。本研究比較了文獻報道中主要采用的分離液一以及分離液二，發現兩種分離液在細胞產量及活性方面無明顯差異。分離液二的操作更簡單、快速，且獲得的心肌細胞適于進行興奮-收縮耦聯特征的檢測。

兩種成年大鼠心肌細胞分離液最大的不同在于消化酶中是否含有BDM（butanedionemonoxime）。本研究發現，兩種分離液獲得心肌細胞的數量和質量并無明顯差異，但含有BDM的消化酶分離的心肌細胞對電刺激的反應性不良，甚至無反應，不會隨電刺激的頻率發生節律性收縮。BDM是肌球蛋白ATP酶抑制劑，能夠抑制橫橋的形成，進而抑制肌絲的收縮和能量代謝。以往研究在酶液中加入高濃度BDM，用以抑制分離過程中心臟過度收縮、減輕缺血再灌注損傷以及維持心臟低能量代謝狀態，進而提高心肌細胞產量［6］。但是BDM能夠影響細胞膜離子通道活性及相關信號傳遞［7-9］、以及細胞縫隙連接［10］，從而阻礙心肌細胞興奮-收縮耦聯的形成，因此建議進行心肌細胞興奮收縮耦聯特征檢測的實驗心肌細胞的分離消化液中應不加BDM。

圖3 IonOptix儀器檢測和記錄成年大鼠心肌細胞肌節舒縮變化和鈣信號改變Note：A，The figure of the shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of cardiomyocytes isolated by the first separation medium；B，The figure of the shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of cardiomyocytes isolated by the second separation medium.Fig.3 The shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of adult rat cardiomyocytes isolated by two different separation medium

本研究總結出在成年大鼠心肌細胞分離過程中應注意以下事項：①灌流液的pH值在7.20～7.30范圍內：本研究方法用純氧進行灌流液氧飽和。而部分文獻報道灌流液的pH值為7.40，配以體積分數為95％O2+5％CO2混合氣體進行氧合，但此法不好控制pH值與氧飽和時間的平衡，易使溶液pH值過低；②灌流液流出端口溫度保持在37℃：由于恒溫水浴泵顯示的溫度為水槽內的溫度，經過Langendorff管路后實際溫度低于37℃，降低酶的效力，因此應根據出口端的溫度調整恒溫水浴泵的溫度，保證進入心臟的酶的效力；③酶液濃度：目前廣泛用于解離細胞間結締組織的消化酶是Ⅱ型膠原酶。胰蛋白酶主要用于分解組織間質的蛋白成分，同時對心肌細胞膜蛋白有破壞作用。因此本實驗采用較低的蛋白酶濃度（0.086 g/L）和較高的膠原酶濃度（0.86 g/L）進行快速消化，酶消化總時間為20min，減少了酶對細胞的破壞，提高細胞產率；④其他：取下心臟到開始主動脈逆行灌流的時間不應超過1 min，所有液體均采用超純水配制，換液體灌流時注意要暫停恒流泵以防灌流液中產生氣泡，全過程液體流速控制在6 mL/min，整個操作（尤其是吹打）過程動作應輕柔。

本研究進一步通過心肌細胞培養和病毒感染驗證獲得的心肌細胞能否適用于實驗研究。成年心肌細胞培養的關鍵在于是否能分離出高比例的長桿狀鈣耐受細胞。有些文章用臺盼藍染色來檢測細胞的存活率［11］，但這一方法有一定的局限性。因為急性分離過程中受到應激的細胞能夠使臺盼藍進入細胞內，在培養的過程中，這些細胞有可能從應激中恢復并很好地存活［12］。判斷細胞活性最可靠的指標是光鏡下可見四角銳利、橫紋清晰、長桿狀，并能對電刺激產生收縮反應［13］。本研究采用的兩種分離液均能穩定地獲取高產率、高活性的成年大鼠心肌細胞，并能進行長時間培養。培養的細胞可以穩定地感染腺病毒，感染效率達90％，因此兩種分離液獲得的成年大鼠心肌細胞均可用于進行目的基因的過表達或敲減，進而研究目的基因對于心肌細胞功能的影響。

在一次興奮-收縮耦聯的過程中，心肌細胞的肌節隨電刺激有規律地收縮和舒張，同時伴隨細胞內鈣離子濃度的改變［14］。IonOptix儀器可以同步記錄單個成年大鼠心肌細胞肌節舒縮活動和鈣信號變化。本研究采用單細胞動緣技術，用bl％peak h和sin exp tau兩個指標進行分析。peak h代表心肌細胞的收縮幅度，由于細胞本身大小有差異，收縮幅度也不同，因此為排除細胞大小造成收縮力的差異，本研究采取心肌細胞收縮幅度與單個心肌細胞長度的百分比（bl％peak h）進行校正，更準確地反映心肌細胞的收縮能力。sin exp tau代表細胞某一功能呈指數衰減所需的時間，在一次興奮-收縮耦聯過程中，反映肌節舒張和肌漿網鈣離子再攝取的速度。

總之，本研究通過兩種分離液的比較，建立了一套穩定、高產率且適用于興奮-收縮耦聯檢測的成年大鼠心肌細胞分離方法。并經過心肌細胞培養和病毒感染的驗證，證明此方法培養的成年大鼠心肌細胞可用于常規的分子生物學實驗和功能研究。同時，本實驗采用IonOptix儀器對分離的成年大鼠心肌細胞的單細胞興奮-收縮耦聯的表征進行了檢測，為今后成年心肌細胞用于心臟電生理研究和分子生物學研究提供了實驗基礎。

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Isolation and culture of adult rat cardiom yocytes and characteristics of excitation-contraction coupling

SUN Min，YU Hai-yi，ZHANG You-yi，LV Zhi-zhen，GAOWei，LIZi-jian
（Department of Cardiology，Peking University Third Hospital，Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides，Ministry of Health，Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences，Ministry of Education，Beijing 100191，China）

Objective To compare two separation medium of isolation of adult rat cardiomyocytes，and to observe the characteristics of excitation-contraction coupling of cardiomyocytes.M ethods The isolated adult rat heartwas hanged on to the Langendorff apparatus for aortic counter-current perfusion and collagenase digestion using two different separation medium.The single cardiomyocytes were cultured and infected with adenovirus.The morphological features of cardiomyocytes were observed with microscope and fluorescent microscope.The shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium were simultaneously recorded by IonOptix equipment.Results 70％rod-shaped with clear-striation adult rat cardiomyocytes could be obtained with the stated two separation medium and cultured in serum-freemedium formore than 7 days.GFP could expressmore than 7 days when the cardiomyocytes were infected with adenovirus.Cardiomyocytes obtained by the first separation medium could not contract with the electrical stimulation，while cardiomyoctyes obtained by the second separation medium could be used for the detection of excitation-contraction coupling.The shortening fraction of sarcomere was 11.61％ ±2.15％and the relaxing time was（0.177± 0.031）s.The amplitude of calcium transient was 30.79％ ±9.74％and the decaying time of calcium transient was （0.300±0.074）s.Conclusion With the stated two separationmedium，adult rat cardiomyocytes can be well isolated，cultured and infected with adenovirus.The second separationmedium can be used for the detection ofexcitation-contraction coupling characteristics.

Cardiomyocyte；Adult rat；Isolation；Culture；Excitation-contraction coupling

R332

A

1671-7856（2014）03-0001-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.001

國家自然科學基金（81100164、81070078、81270157）；高等學校博士學科點專向科研基金（20100001110101、20110001120015）。

孫敏（1988-），女，碩士生。E-mail：sunmin0602@163.com。

李子健（1970-），男，副研究員，碩士生導師，從事心血管基礎研究。E-mail：lizijian@bjmu.edu.cn。

2014-01-15

研究報告