異氟烷預處理對大鼠肝缺血再灌注時腦線粒體鈣及線粒體轉運通道的影響

沈 潔，從長慧

（中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉科，沈陽 110004）

異氟烷預處理對大鼠肝缺血再灌注時腦線粒體鈣及線粒體轉運通道的影響

沈 潔，從長慧

（中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉科，沈陽 110004）

目的 通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后腦線粒體游離鈣、線粒體轉運通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）及外周血中S-100β蛋白含量的變化，明確異氟烷預處理對大鼠肝部分缺血再灌注時腦損傷是否具有保護作用及可能的機制。方法 SD大鼠75只隨機分成假手術組（S組）；缺血再灌注組（I/R組）：肝缺血60 min，再灌注120 min；異氟烷預處理組（ISO組）：肝I/R前60 min ISO預處理30 min，后用空氣洗脫30 min：CsA+ISO組，CsA50 mg/kg靜脈內注射，30 min后同ISO組；CsA組，I/R前30 min CsA50 mg/kg靜脈內注射。再灌注24 h迅速斷頭取前腦，分離線粒體進行線粒體游離鈣、MPTP含量檢測，各組分別于缺血前及再灌注120 min后抽取靜脈血采用雙抗體夾心-ELAISA法測定S-100β蛋白含量。結果 I/R組（287.32± 26.17）線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，高于S組（198.54±21.02）和ISO組（209.74±29.49）（P＜0.05）；CsA+ ISO（267.31±37.52）明顯高于ISO組（P＜0.05）；CsA（288.63±23.15）組與I/R組間比較差異無顯著意義（P＜0.05）；I/R組（1.73±0.24）的ΔS與S組（2.36±0.35）和ISO組（2.11±0.32）相比明顯減少（P ＜0.05），既MPTP大量開放，而后兩組的差異無統計學意義（P＜0.05）；I/R組與CsA+ISO組（1.72±0.34）和CsA組（1.77 ±0.35）△S之間差異無統計學意義（P＜0.05）；CsA+ISO組的ΔS值與ISO組相比明顯降低（P＜0.05）。外周血液S-100β蛋白I/R組明顯高于S組和ISO組（P＜0.05）；CsA+ISO組與ISO組比較顯著升高（P＜0.05），I/R組，CsA+ISO組和CsA組與缺血前比較明顯升高（P＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五組無顯著性差異（P＜0.05）。結論 大鼠肝部分缺血再灌注后對腦組織造成了一定程度損傷，而異氟烷預處理對此損傷具有一定保護作用；其作用的機制可能與異氟烷抑制MPTP開放，降低線粒體游離Ca2+濃度，防止了線粒體Ca2+超載有關。

異氟烷；肝缺血再灌注；腦；大鼠；線粒體鈣；線粒體轉運通道

腦保護是圍術期醫學的重要內容，特別是經歷手術創傷及全麻后大腦功能會受到怎樣的影響越來越受到人們的關注，這就要求我們圍術期醫生特別是麻醉醫生不僅要保證患者生命安全還要最大程度保證手術麻醉后病人腦功能不受影響。雖然圍術期腦保護措施有很多種，但通過應用藥物使腦組織對損傷不易感的預處理、后處理及同時處理干預是目前已知的圍術期治療的重要干預措施之一［1-3］。筆者前期研究表明吸入麻醉藥異氟烷（isoflurane，ISO）預處理對鼠腦及肝直接的缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷具有保護作用，且發現這種作用與抑制線粒體通透性轉運通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP），降低線粒體Ca2+超載有關［4］。但臨床工作中往往存在某一臟器的直接損傷可能會引起其遠隔臟器的損傷。有研究表明血漿和腦脊液中S-100β蛋白含量的變化與神經系統的疾病和損傷有關，當中樞神經系統細胞損傷時S-100β蛋白從胞液中滲出進入腦脊液和（或）經受損的血腦屏障進入血液中，因此S-100β蛋白在血漿中的濃度變化可以反映中樞神經系統損害程度，并已成為判斷和評估腦損傷預后的特異性指標［5］。目前，麻醉藥物對肝臟手術后遠隔器官的保護方面的研究還很少［6-7］。本研究通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后腦組織線粒體游離鈣、MPTP含量檢測及外周血中S-100β蛋白含量的變化，探討大鼠肝部分缺血再灌注后對腦組織是否造成了損傷、異氟烷預處理對其是否具有保護作用，通過應用環孢菌素A（MPTP特異性阻滯藥，cycloporin A，CsA）后觀察上述指標的變化進一步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物選擇及分組

健康雄性清潔級SD大鼠75只，體重在280～350 g（北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK （京）2009-0004】，實驗動物使用合格證號：【SYXK （遼）2010-0008】，分5組每組15只。假手術組（S組），缺血再灌注組（I/R組），異氟烷預處理組（ISO組），CsA+ISO組和CsA組

1.2 實驗方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作建立大鼠肝缺血再灌注模型［8］，10％水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉后固定于實驗臺上，氣管切開，連接小動物呼吸機，左頸內靜脈穿刺，持續輸注乳酸鈉林格氏液7 mL/kg·h，水合氯醛持續泵入，維持麻醉狀態，采用腹部弧形切口，充分顯露第一肝門部，入腹后分離肝十二指腸韌帶，分離膽總管，應用無創動脈夾阻斷肝左葉及中葉血流，造成70％肝臟缺血，但不阻斷右葉肝血流，60 min后松開動脈夾，再灌注120 min。整個實驗過程利用燈泡加熱，使直腸溫保持在36.7℃ ～37.3℃。

1.2.2 異氟烷預處理 將鼠吸入異氟烷，使異氟烷的 肺 泡 最 低 有 效 濃 度 （minimal alveolar concentration，MAC）維持在1.0 MAC，（Datex氣體監測儀監測）。

1.2.3 分組

S組：入腹后只分離肝十二指腸韌帶，但不阻斷肝門血供；

I/R組：肝缺血60 min，再灌注120 min；

ISO組：肝I/R前60 min ISO（雅培公司）預處理30 min，后用空氣洗脫30 min；

CsA+ISO組：CsA（sigma公司）50 mg/kg靜脈內注射，30 min后同ISO組；

CsA組：I/R前30 min CsA 50 mg/kg靜脈內注射。

1.2.4 取材及檢測

再灌注24 h迅速斷頭取前腦，置于冰塊上并用冰生理鹽水沖洗，采用低溫（0℃ ～4℃）差異離心法分離前腦線粒體，用分離介質（0.25 mol/L蔗糖、0.0001 mol/L EDTA-2Na、0.005 mol/L的Tris-HCl、0.8％NaCl，pH=7.4）制備線粒體懸浮液。取出少許懸浮液，用中性紅-詹納斯綠B染色后，在高倍顯微鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒即線粒體。

MPTP開放程度的測定 用1601型紫外分光光度計（島津公司，日本）在540 nm波長處記錄每分鐘吸光度的變化，平衡后的吸光度變化值（△S）反映 MPTP開放的程度，△S越小，代表MPTP開放的程度越大，線粒體蛋白濃度為0.5 mg/m L。

線粒體游離Ca2+濃度的測定 根據文獻［9］介紹的方法略加改進。以Fura-2/AM（Sigma公司，美國）為Ca2+熒光指示劑，用850型熒光分光光度計（Hitachi公司，日本）測定線粒體游離Ca2+濃度，發射波長510 nm，以430 nm激發光譜掃描。根據實測熒光值（F）、最大（Fmax）及最小（Fmin）熒光強度比值計算出 Ca2+濃度，［Ca2+］i =Kd{（F-Fmin）/（Fmax-F）}，Kd為熒光指示劑的介電常數，Fura-2=224 nmol/L，（單位為nmol/mg·L）。

各組分別于缺血前及再灌注120 min后抽取靜脈血2 mL，靜置15 min后，3000 r/min離心20 min，取血清-80℃冰箱保存，測定S-100β蛋白含量，采用雙抗體夾心-ELAISA法檢測（購自大連生物科技有限公司），按說明書操作。

1.3 統計學處理

所有計量數據用SPSS12.0軟件進行統計學處理，以（ˉ±s）表示，組間差異比較采用單因素方差（One-Way ANOVE）分析，LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線粒體Ca2+濃度的變化

I/R組Ca2+濃度（287.32±26.17）明顯高于S組（198.54±21.02）和ISO組（209.74±29.49）（P＜0.05）；ISO組Ca2+濃度高于S組，但差異無顯著意義（P ＞ 0.05）；而 CsA+ISO組 Ca2+濃度（267.31±37.52）明顯高于 ISO組（P ＜0.05）；CsA組（288.63±23.15）與I/R組間差異無顯著意義（表1）。

2.2 MPTP開放程度（△S）的變化

與I/R組（1.73±0.24）相比，S組（2.36± 0.35）和ISO組（2.11±0.32）的△S明顯增加（P＜0.05），而后兩組的差異無統計學意義（P＞0.05）；I/R組與 CsA+ISO組（1.72±0.34）和 CsA組（1.77±0.35）△S之間差異無統計學意義（P ＞0.05）；CsA+ISO組的△S值與ISO組相比明顯降低（P＜0.05）（表1）。

2.3 外周血中S-100β蛋白含量的變化

再灌注后，I/R組S-100β蛋白含量顯著高于S組（P＜0.05）；ISO組與I/R組相比S-100β含量明顯下降（P＜0.05），CsA+ISO組和CsA組與S組比較顯著升高（P＜0.05），與ISO組比較也升高顯著（P＜0.05），I/R組，CsA+ISO組和CsA組與缺血前比較明顯升高（P ＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五組無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 S-100β蛋白含量的變化Tab.2 The contents of S-100βprotein in serum

3 討論

臨床工作中往往存在某一臟器的直接損傷也可引起其遠隔臟器（如腦組織）的損傷，這些均與腦灌注減少腦供血供氧失衡有關，血腦屏障及血管壁的破壞使腦缺血加重，自由基的急劇增加、腦微循環的病生理改變是再損傷的基礎［10-11］。肝缺血再灌注損傷不僅可以造成肝臟局部的損害，同時激活網狀內皮系統釋放大量的細胞因子、蛋白水解酶，氧自由基和氧化氮等進入血液循環到達遠隔器官如心、腦、腎等，損害這些臟器。S-100蛋白是一種高度酸性的鈣結合蛋白，根據其亞單位結構可分為S-100αα（S-100αo）、S-100αβ（S-100α）、S-100ββ （S-100β）三種。在生理情況下，其中S-100ββ蛋白特異地存在于中樞神經膠質細胞，星形細胞，少突膠質細胞，小膠質細胞及大膠質細胞中。因此，S-100β蛋白被認為是神經膠質的標記蛋白，是腦特異蛋白［12］。缺血性疾病急性期血清和腦脊液中的S-100β蛋白升高顯著，主要原因是由于神經膠質細胞壞死后S-100β蛋白的釋放和血腦屏障受損后通透性的增高，S-100β蛋白在腦脊液和外周血中的濃度反映中樞神經受損害的程度，故作為中樞神經系統疾病的生化標記物［13-14］。本實驗中I/R組缺血再灌注120 min后外周血液S-100β蛋白顯著高于對照組，說明大鼠肝的損害造成了鼠腦細胞的損傷和血腦屏障的破壞。ISO組雖然與缺血前比較S-100β蛋白有一定升高，但與I/R組比較顯著下降，表明異氟烷預處理對鼠腦起到了一定保護作用，而CsA+ ISO組和CsA組外周血液S-100β蛋白的增加與I/R組基本一樣，說明異氟烷預處理對鼠腦的保護作用一定程度上受到的抑制與CsA有關，而單純應用CsA后外周血液S-100β蛋白并未有變化。

肝臟I/R損傷的發病機制十分復雜，其中鈣離子超載和MPTP開放是一個重要的原因［15-16］。正常情況下，神經元膜內外存在著極大的鈣離子電化學梯度，細胞的調控作用是細胞質Ca2+維持在0.1～1.01 umol/L，而細胞外Ca2+則高達上萬倍約1.5 mmol/L，腦損傷后腦缺血再灌注可導致腦內高能磷酸物質快速消耗，不足以維持細胞內外的正常離子梯度。從而使電壓依賴調控的鈣通道開放，造成嚴重的鈣穩態失衡，細胞內鈣超載，當超過線粒體緩沖濃度范圍時，產生線粒體鈣超載，Ca2+增加可激發胞質和胞核的一系列反應造成組織損傷。線粒體通透性轉運通道是一種由線粒體內膜和外膜跨膜蛋白共同構成的高電導非選擇性通道。其分子組成尚不完全清楚，許多證據表明它可能是由腺苷酸轉移酶（translocase of adenine nucleotides，ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）和親環素D（cyclophilin D，CyP-D）組成的［17-18］。正常情況下MPTP復合體僅允許相對分子量小于1.5×103的化合物通過，因此，它有維持線粒體基質和胞質之間滲透壓梯度的作用，致使高分子量化合物在線粒體基質內的濃度高于在線粒體膜間隙和胞質的濃度。許多因素如Ca2+、自由基或膜電位降低都可觸發MPTP開放，選擇性釋放細胞色素 C及凋亡誘導因子（apotosis inducing factor，AIF）等物質，提示MPTP開放可能是導致細胞凋亡的機制之一。我們利用MPTP增大時線粒體膜內外滲透失衡，導致吸光度明顯減少的原理，檢測了各組MPTP開放程度，發現肝I/R損傷后腦線粒體MPTP大量開放，同時腦組織線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，這可能是線粒體自身調節Ca2+穩態的不良后果，而Ca2+濃度增加又可誘發MPTP開放，產生正反饋的惡性循環，這與Kobayashi的研究［19］結果一致；表明肝缺血60 min，再灌注120 min后對腦產生了明顯的損傷；而大鼠吸入麻醉藥ISO進行預處理后再進行肝I/R線粒體游離Ca2+濃度明顯降低，異氟烷預處理防止了線粒體Ca2+超載，起到了一定腦保護作用；另外，發現進行ISO預處理后鼠腦的MPTP的開放受到明顯抑制，MPTP受到抑制后使線粒體游離Ca2+濃度降低，而Ca2+濃度降低又可抑制MPTP的開放，因此減輕了I/R對鼠腦的損傷，表明ISO預處理作用可能是通過抑制MPTP開放介導的。而Ca2+又是MPTP開放的主要誘發因子，過量的Ca2+超過線粒體自身的承受限度時，則促使MPTP開放，使線粒體基質代謝物喪失，膜電勢消失，ATP耗竭，線粒體腫脹，造成細胞損傷［17］。Kobayashi等人［19］的研究顯示應用環孢菌素A后可以減輕海馬CA1的遲發性細胞損傷，證明MPTP與遲發性神經損傷有關，并且是I/R所致腦細胞損傷的關鍵部位。所以，減少線粒體 Ca2+超載，抑制MPTP的開放，維持線粒體形態及功能正常，某種程度上可能防止腦神經細胞死亡，起到腦保護作用。本實驗中我們也設立了CsA組（藥物空白對照），其線粒體游離Ca2+濃度和MPTP結果與I/R組比較均沒有顯著性差異，說明特異性MPTP阻滯劑CsA本身對大鼠腦損傷沒有明顯作用；同時我們又對鼠進行ISO預處理前采用CsA靜脈注射干預后，發現線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，MPTP大量開放，逆轉了ISO預處理使線粒體游離Ca2+濃度降低及抑制MPTP開放作用，取消了ISO預處理的腦保護作用，進一步證明ISO預處理作用機制可能是與抑制MPTP開放有關。

CsA是臨床應用的一種免疫抑制劑，且有一定肝毒性。有研究發現CsA對細胞凋亡有一定調節作用，既有抑制細胞凋亡作用也有誘導細胞凋亡作用［20］。CsA與 CyclophilinD組成復合體來抑制MPTP的開放，而我們前期研究發現異氟烷腦保護作用與抑制MPTP的開放有關，那么異氟烷與CsA是否有相同作用部位，從而取消了異氟烷腦保護作用，這有待于進一步研究。我們設立了CsA組，從線粒體鈣水平的檢測看并未有明確的細胞損傷，也沒有顯示有細胞保護作用，這可能與動物模型或使用劑量有關。此研究我們沒有進行相關凋亡因子的檢測，另外肝缺血再灌注損傷所造成的腦組織一定程度損傷的具體機制及可能的信號傳導也沒有進行研究，這有待于今后進一步研究探討。

本研究通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后外周血S-100β蛋白含量的變化，結合腦組織線粒體游離鈣和線粒體通透性轉運通道的變化，明確大鼠肝部分缺血再灌注后對鼠腦造成了損傷，而異氟烷預處理對此損傷具有一定保護作用；并且通過應用特異性MPTP阻滯劑CsA干擾后，進一步探討了其作用的機制可能與抑制MPTP開放，降低線粒體游離Ca2+濃度，防止了線粒體Ca2+超載有關。

［1］Johnsen D，Murphy SJ.Isoflurane preconditioning protects neurons from male and female mice against oxygen and glucose deprivation and is modulated by estradiol only in neurons from femalemice［J］.Neuroscience，2011，9（1）：53-60.

［2］Kitakaze M.How tomediate cardioprotection in ischemic heartsaccumulated evidence of basic research should translate to clinical medicine［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（2）：217-223.

［3］Adamczyk S，Robin E，Simerabet M，et al.Sevoflurane pre-and post-conditioning protect the brain via the mitochondrial KATPchannel［J］.British Journal of Anaesthesia，2010，104（2）：191 -200.

［4］劉東俊，呂金，陳華，等.異氟烷預處理對大鼠肝部分缺血再灌注時腦的保護作用［J］.中國醫師雜志，2013，15（1）：25-28.

［5］Kanner AA，Marchi N，Fazio V，et al.Serum S-100beta：a noninvasive marker of blood-brain barrier function and brain lesion［J］.Cancer，2003，97（11）：2806-2813.

［6］Minjae K，Sang WP，Mihwa K，et al.Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against renal ischemiareperfusion-induced liver and intestine injury ［J］.Anesthesiology，2011，114（2）：363-373.

［7］Nasser AT，Mohammed MH，Khulood AF，etal.Traumatic brain injury：neuroprotective anaesthetic techniques，an update［J］.Injury，Int.J.Care Injured，2009，40（4）：75-81.

［8］Martins PN，Neuhaus P.Surgical anatomy of the liver，hepatic vasculature and bile ducts in the rat［J］.Liver Int，2007，27（3）：384-392.

［9］Mccormack JG， Browne HM， Dawes NJ.Studies on mitochondrial Ca2+transportandmatrix Ca2+using fura-2-loaded rat heartmitochondria［J］.Biochim Biophys Acta，1989，97（3）：420-427.

［10］李少清，范廷君，馬建國.腦損傷的腦保護探討［J］.中國實用神經疾病雜志，2007，10（3）：160-161.

［11］王士雷，劉志林.線粒體鈣單向轉運體在遠距預處理腦保護中的作用及其機制［J］.山東醫藥，2011，51（39）：9-11.

［12］Donate R.Functional roles of S-100 proteins，calcium-birding proteins of the EF-hand type［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1450（3）：191-231.

［13］Miqsler U.S-100 protein and neuronspecific enolase concentration in blood as indication of infaretion volume and prognosis in acule ischemie stroke［J］.Stroke，1997，28：1956-1960.

［14］許贊峰.S-100β蛋白與中樞神經系統損傷的研究進展［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2004，9（12）：573-575.

［15］Li L，Zuo Z.Isoflurane postconditioning induces neuroprotction via akt activation and attenuation of increased mitochondrialmembrane permeability［J］.Neuroscience，2011，10（1）：22-28.

［16］葛廷，王小琦，廖世奇，等.肝缺血再灌在損傷機制及相關細胞因子關系的研究進展［J］.甘肅醫藥，2010，29（5）：499 -503.

［17］Javadov S， Karmazyn M， Escobales N.Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening as a PromisingTherapeutic Target in Cardiac Diseases［J］.JPharmacol Exp Ther，2009，330 （3）：670-678.

［18］Akopova OV.The role of mitochondrial permeability transition pore in transmembrane Ca2+-exchange in mitochondria［J］.Ukr Biokhim Zh，2008，80（3）：40-47.

［19］Kobayashi T.The roles ofmitochondrial permeability transition in brain ischemia［J］.Hokkaido Igaku Zassi，2000，75（4）：243 -252.

［20］曾赟.環孢菌素A在細胞凋亡中的作用［J］.南京鐵道醫學院學報，2001，20（2）：137-139.

Preconditioning effect of isoflurane on m itochondria free calcium concentrate and m itochondria permeability transition pore after liver ischem ia-reperfusion injury in rat brain

SHEN Jie，CONG Chang-hui
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the protective effect and themechanism of isoflurane preconditioning on rat brain tissue suffering from rat liver ischemia-reperfusion injury.Methods 75 SD rats were randomly divided into five groups，sham group（S group）；ischemia-reperfusion group（I/R group）：liver ischemia for 60 min，reperfusion for 120min；isoflurane preconditioning group（ISO group）：60 min before liver I/R，ISO pretreatment for 30 min；CsA+ISO group；CsA（MPTP specific blocker）50 mg/kg intravenous injection，the same as ISO group after 30 min；CsA group：CsA 50 mg/kg intravenous injection.30 min before I/R.The animals were killed 24 h after ischemia and their brain were excised formeasurement ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）and calcium content in mitochondria.The measurement of content of S-100βprotein in serum before ischemia and 120min after reperfusion through the application of Elisa kit.Results Themitochondrial Ca2+concentration of I/R group（287.32±26.17）was higher than that in S group （198.54±21.02）and the ISO group（209.74±29.49）（P ＜0.05），and Ca2+concentration of CsA+ISO group （267.31±37.52）was higher than the ISO group（P＜0.05）；therewas not statistical significance between I/R and CsA group（288.63±23.15）（P ＜0.05）.MPTP were more opened in I/R group（△S：1.73±0.24）than that in S group （△S：2.36±0.35）and ISO group（△S：2.11±0.32）（P＜0.05），butMPTPweremore opened in CsA+ISO group than that in ISO group（P ＜0.05）.The content of S-100βprotein in serum was significantly higher in I/R group than that in sham and ISO groups（P＜0.05），and the contentof S-100βprotein in serum was significantly higher in CsA+ISO group than in the ISO groups（P ＜0.05）.Conclusion The liver ischemia-reperfusion may injury the brain of the rat and isoflurane preconditioning can protect the brain on the rat.The reduce ofmitochondria calcium overload and inhibition of MPTP opening are involved in themechanism.

Isoflurane；Liver ischemia-reperfusion； Brain； Rat； Mitochondria calcium；Mitochondrial permeability transition pore

R971.2 R332

A

1671-7856（2014）03-0025-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.006

遼寧省教育廳課題項目（2008792）。

沈潔（1963-），碩士生導師，博士，副教授。研究方向：麻醉藥物與器官保護。E-mail：Shenjie-63@163.com。

2014-02-11

研究報告