精子特異性Sleeping Beauty轉座酶轉基因小鼠模型的建立

路迎冬，張 旭，馬 婧，張連峰，馬元武

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

精子特異性Sleeping Beauty轉座酶轉基因小鼠模型的建立

路迎冬，張 旭，馬 婧，張連峰，馬元武

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

目的 建立精子特異性表達Sleeping Beauty（SB）轉座酶轉基因小鼠模型，為研究SB轉座子在小鼠中的應用提供工具。方法 克隆精子特異性啟動子用以驅動SB轉座酶基因的表達，建立精子特異性表達SB轉座酶的載體，利用顯微注射方法建立以C57BL/6J為背景的精子特異性表達SB轉座酶的轉基因小鼠。PCR鑒定首建鼠的基因型，western blot（WB）和免疫組織化學（IHC）檢測SB轉座酶基因在小鼠生殖腺睪丸中的表達情況，篩選睪丸中高表達SB轉座酶的轉基因小鼠。結果 顯微注射方式獲得了5只首建小鼠，其中3只能穩定傳代，利用WB和IHC成功的篩選出一株在精子中高表達SB轉座酶的轉基因小鼠。結論 成功建立了精子特異性高表達SB轉座酶轉基因小鼠模型，為將SB轉座子作為一種基因工程工具應用于小鼠基因修飾模型的建立提供非常重要的工具資源。

DNA轉座子；Sleeping Beauty；轉座酶

自1950年轉座子發現以來，轉座子作為一種重要的基因工程功能分析工具，在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）［1］、線蟲（Caenorhabditis elegans）［2］、家蠶（Silkworm）［3］等低等生物中發揮著重要的作用。隨著多個物種基因組序列圖譜的完成，在脊椎動物中發現了大量轉座子相關序列，其中人類基因組中40％的序列與轉座子序列相關，可見轉座子在人類進化過程中發揮著非常重要的作用［4］。1997年，Zoltan Ivics等［5］對鮭魚來源的Tc1樣轉座子序列類比分析，并利用分子生物學手段進行重構，建立了一種能夠在哺乳動物細胞中轉座的DNA轉座子，命名為“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）。SB轉座子屬于Tc1/mariner家族成員［6］，作為一種DNA轉座子，采用“剪切-黏貼”（cut and paste）的轉座模式。轉座反應的發生需要轉座序列（能夠被轉座酶所識別的一段反向末端重復序列（IR））和轉座酶同時存在［7］。隨后的研究發現該轉座系統在斑馬魚、大小鼠等體內也都表現出較高的轉座活性［6，9］。轉座子序列在轉座酶存在情況下，能夠發生轉座，去除轉座酶時，轉座子序列穩定存在［8］，利用這一特性，將轉座酶和轉座子序列分離，建立包含轉座子載體和轉座酶表達載體的二元轉座系統［10］，二者分離提高了轉座系統的安全性，利用轉座子序列可以攜帶一段外源DNA序列進入宿主基因組，應用于轉基因、基因突變和基因治療等方面［12-15］。為將SB轉座系統應用于小鼠體內篩選突變基因，建立基因修飾小鼠模型，并使得突變基因能夠在種系中穩定遺傳，本研究通過克隆小鼠精子特異性的Prm1啟動子，構建能夠在精子中特異性表達SB轉座酶的轉座載體，利用顯微注射的方式建立精子特異性表達SB轉座酶的轉基因小鼠。該研究將為SB轉座系統應用于小鼠的基因工程功能分析提供重要的工具小鼠資源。

1 材料和方法

1.1 Prm1啟動子的克隆

利 用 引 物：Prm1-S：5’-TACGCGTGTGA GGTCCCACTCC-3’和Prm1-AS：5’-TGCTAGCT

GGCTTGGCCGGGAG-3’（上海英俊生物技術有限公司合成，中國），以小鼠基因組DNA為模板，擴增片段大小為801 bp的精子特異性啟動子，將PCR產物進行 TA克隆，測序正確后，用 Mlu I （Takara公司）和Nhe I（Takara公司）酶切目的片段，并連接到經這兩個酶切的pCDNA3.1（+）的載體上完成對 CMV啟動子的替換，即完成 Prm1-expression載體構建。

1.2 SB轉座酶表達質粒的構建以及轉基因小鼠制作

利用Nhe I和Xho I從質粒pCDNA3.1（+）-SBase［10］中回收SB轉座酶基因片段（1022 bp），將目的基因連入含有 Prm1啟動子的載體（Prm1-expression）中完成Prm1-SBase表達載體的構建。利用Mlu I/Nhe I，Mlu I/Xho I分別對構建的 Prm1-SBase質粒進行雙酶切驗證。然后將酶切驗證正確的Prm1-SBase載體經Pvu I（Takara公司）線性化，Sephedex G50柱純化，調整濃度至5 ng/μL，用于顯微注射。將純化好的 DNA片段注射到 SPF級C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK（京）2012-001】），用ICR小鼠作為假孕受體小鼠（購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK（京）2012-001】），制備轉基因小鼠（TE2000U纖維注射儀）。實驗在本研究所衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室完成【SYXK （京）2013-002】，實驗中涉及動物操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所動物使用與管理委員會批準，批準號為ILAS-GC-2012-001。

1.3 SB轉座酶轉基因小鼠的基因型鑒定

首建鼠在出生7～14 d時，用剪腳趾標記法標記，收集剪下的組織，堿裂解法提取基因組DNA［11］，PCR法對首建鼠進行篩選。PCR上游引物為SB-S1：5’-TCCCAGAACAACAGCAAAG-3’，下游引物為 SB-AS1：5’-CATCAGACCAGAGGAC ATTTC-3’（上海英俊生物技術有限公司合成，中國）。PCR反應體系20μL（PCR反應相關試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應條件：95℃5 min；（95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃10 min；4℃保溫。擴增片段大小為224 bp。

1.4 western blot檢測轉座酶在小鼠睪丸中的表達

頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取陽性轉基因小鼠的F1代和非轉基因 （non-transgenic，NTG）對照小鼠睪丸的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取20μg蛋白經高溫變性后，進行12％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至 NC膜上（Millipore，美國），用含有5％脫脂奶粉的 TBST（20 mmol/L Tris，0.05％ Tween，pH 7.6）封閉NC膜，選擇一抗為抗SBase的單克隆抗體（1：1000稀釋，MAB2798，R＆D，美國），二抗為HRP-偶聯的羊抗鼠抗體（1∶10000稀釋，ZB-2305，康成生物，中國）；內參選用HRP-偶聯的βactin單克隆抗體（1∶10000稀釋，KC-5A08，中杉金橋，中國），通過HRP在暗室進行顯色。用Image J分析軟件分析western blot條帶灰度，確定蛋白的表達量。

1.5 轉座酶在睪丸中的組織染色觀察

取2月齡的轉基因小鼠和同窩陰性小鼠的睪丸，固定液中固定23 h后，經過脫水、石蠟包埋、組織切片。其中一組用于HE染色［12］。另一組進行免疫組織化學染色，經過異丙醇以及梯度乙醇脫水，枸櫞酸納抗原熱修復，冷卻至室溫后用3％ H2O2去除內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗（1：100稀釋，MAB2798，R＆D，美國），濕盒內4℃過夜；PBS洗3次，每次5 min，加入羊抗鼠二抗（具體用法詳見二步法免疫組化試劑盒，PV-9002），PBS洗3次，每次5 min，然后進行DAB顯色，終止反應，梯度乙醇脫水、異丙醇透明、封片，掃描病理切片。

2 結果

2.1 表達SB轉座酶轉基因小鼠的制備及基因型鑒定

利用引物Prm1-S和Prm1-AS擴增的Prm1啟動子片段大小為 801 bp，將構建完成的 Prm1-expression與從質粒pCDNA3.1（+）-SBase中回收的SBase片段，大小為1022 bp連接，完成 Prm1-SBase的載體構建，利用Mlu I/Nhe I，Mlu I/Xho I分別對構建的Prm1-SBase質粒進行雙酶切驗證（圖1a）。Prm1-SBase結構示意圖（圖1b）。

將線性化的 Prm1-SBase（6498 bp）片段（圖1c），顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵雄性核中，提取出生小鼠的基因組DNA，PCR檢測SB轉座酶基因，大小為224 bp片段，獲得含有目的基因的首建鼠，共獲得5只陽性轉基因小鼠，其中#1、#4、#9能夠穩定傳代，#5、#12不傳代。基因型鑒定結果（圖1d）。

2.2 SB轉座酶在小鼠睪丸中顯著高表達

圖1 SB轉座酶轉基因小鼠的制備Note：M：DNA molecular weightmarker DL15000；a，Lane 1：Prm1 promoter sequence was coloned from mouse genomic DNA using primer Prm1-S and Prm1-AS（801 bp）；Lane 2：DNA fragment recovered from pCDNA 3.1（+）which digested with restriction endonuclease Mlu I and Xho I （4671 bp）；Lane 3：SBase gene fragment recovered from pCDNA3.1（+）-SBase using Nhe Iand Xho I（1022 bp）；Lane 4：Prm1-SBase plasmid was digested using Mlu Iand Xho I（4671 bp，985 bp，842 bp）；Lane 5：Prm1-SBase plasmid was digested with M lu Iand Nhe I.b，Schematic of Prm1-SBase plasmid.c，The linearized SBase expression plasmid；Prm1-SBase plasmid was linearized using Pvu Iand prepared formicroinjection.d，Transgenic mice produced from pronucleimicroinjection.Lane 4，7，8，12，15 are transgenic positivemouse representing the#1，#4，#5，#9，# 12；Lane 5，6，9，10，11，13，14，16，17，18 are negative.Fig.1 Themanufacture of SBase transgenic mouse

圖2 SB轉座酶轉基因小鼠的睪丸中WB分析

提取傳代的3個轉基因小鼠的F1代雄性睪丸總蛋白，WB分析表達量，結果表明3個轉基因小鼠品有2只小鼠有明顯的高表達，其中首建鼠 #1 （F1）的SB轉座酶表達量最高（圖2a）。WB的灰度掃描結果（圖2b）。

2.3 SB轉座酶轉基因小鼠睪丸組織學觀察（彩插6）

基于前面的WB結果，發現F1和F4轉基因小鼠SBase表達量相對較高，為進一步確定轉座酶在小鼠睪丸組織中具體表達細胞類型，對其進行組織學觀察，圖3中的a，c，e為HE染色，b，d，f為免疫組織化學染色，圖3a和3b是野生對照小鼠，圖3c和3d是F1轉基因鼠，圖3e和3f是F4轉基因鼠。與對野生對照組a比較，轉基因小鼠睪丸組織中細胞在排列的層次上有所減少，其中F1表現最為顯著，這可能與轉座酶表達有一定關系。圖3d和3f顯示，SB轉座酶在精子形成的各個時期都有表達，但在成熟的精子細胞內表達量最高。同時兩個首建轉基因小鼠比較，F1的表達更加集中于成熟期的精子細胞，且表達量較高。

3 討論

用于基因修飾動物模型的制備手段，既包括傳統的轉基因、基因敲除、基因敲入，也包含近年來出現的基因修飾手段，如辛酯核酶基因敲除、TALEN技術以及CRISPR/Cas系統［13］，使得基因打靶可以不經過ES細胞的篩選階段，直接通過原核注射的方式獲得基因修飾動物模型。但這些技術也存在一些缺陷，只能針對特定的已知基因進行操作，并且在進行大規模操作時只能一個一個基因單獨設計，難以實現高通量制作基因工程動物模型。而轉座子是一種隨機插入的方式，能夠大規模、高效率的建立基因修飾動物模型并能篩選獲得一些未知基因，進行基因功能研究。轉座子技術對于基因功能研究仍然具有非常重要意義。

Zoltan Ivics等［5］通過對鮭魚來源的轉座子家族進行系統發育分析，發現了一種新的Tc1樣轉座子功能結構域，此結構域在1～1.5千萬年前活躍過（表現出轉座活性），利用分子生物學手段對SB原始轉座子序列進行點突變篩選，獲得了有活性的轉座子。這次的轉座活性是在沉睡后的又一次蘇醒，有失而復得之意，遂隨命名為“Sleeping Beauty（睡美人）”，簡稱SB。SB是一種Tc1/mariner樣轉座子，來源于鮭魚（salmanoid）基因組，能夠在多種哺乳動物細胞內發生轉座。相對于其他轉座子，SB具有明顯的鄰近位點轉座偏好性。近年來隨著對SB轉座酶的不斷優化，使得SB轉座系統得到不斷優化，如SB100×［14］。此外，SB在基因組中的轉座反應表現出更大的隨機性，不像PB轉座子的轉座活動多集中在轉錄單元內部和轉錄調節區域［15-16］；而且相對于PB轉座子，SB轉座子末端重復序列的增強子或啟動子活性基本可以忽略［17-18］；另外，在哺乳動物基因組內不存在SB轉座子相關序列，從而排除潛在的交叉轉座現象，這一現象在PB中明顯存在［19］。利用SB轉座酶的這些優勢可以獲得多種基因工程小鼠，從而達到研究目的。

雖然SB轉座子在小鼠基因功能分析研究中應用前景廣闊，但是由于目前國內缺少有效的表達SB轉座酶的小鼠資源，嚴重限制了SB轉座子在小鼠基因功能研究中的應用。通過運用分子生物學實驗技術和WB、免疫組化表型分析，本研究成功建立了一種在睪丸組織中高表達SB轉座酶的轉基因小鼠模型，由于本研究運用了精子特異性的Prm1啟動子，因此集中研究了睪丸組織中SB轉座酶的表達狀況，結果為SB在小鼠中的應用提供轉座酶工具小鼠資源，為將其應用于大規模基因修飾動物模型的建立提供新方法。建立的轉座酶轉基因小鼠，不僅需要在小鼠體內轉座，捕獲內源基因，更重要的是能夠實現轉座位點的穩定遺傳，這有待后續的繼續研究。

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Establishment of sperm specific Sleeping Beauty transposase-expressing transgenic mouse

LU Ying-dong，ZHANG Xu，MA Jing，ZHANG Lian-feng，MA Yuan-wu
（Key Labortaory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science；
Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

Objective To establish the sperm specific Sleeping Beauty（SB）transposase-expression transgenic mouse for the study of the genetic modification mediated by transposon system in mouse.M ethods Prm1 promoter was cloned from mouse genomic DNA to drive the expression of SB transposase.The transgenic mice were generated by microinjection.The gene type of transgenic line was identified by PCR.The expressing level in testis was determined by western blot and immunohistochemistry（IHC）staining.Results Five lines of transposase transgenicmice were obtained bymicroinjection and three can be germline.Onemouse line with higher expression level of transposase in the testis was obtained.Conclusion One transgenic mouse model with Sleeping Beauty transposase-expression was successfully established.Thismodel will greatly contribute to the research of genetic modificationmediated by transposon inmouse

DNA transposon；Sleeping Beauty；Transposase

馬元武。E-mail：mayuanwu@gmail.com。

R332

A

1671-7856（2014）03-0034-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.008

協和青年基金（2012J25）；國家重大科技項目（2012BA139B02）。

路迎冬（1988-），女，碩士生，研究方向：比較醫學。E-mail：luyd@cnilas.org。

2013-10-08

研究報告