兔VX2肝癌模型制作改良及影像學評價

杜 童，韓 琳，牛洪欣，張西坤

（山東省醫學科學院附屬醫院普外科，濟南 250031）

兔VX2肝癌模型制作改良及影像學評價

杜 童，韓 琳，牛洪欣，張西坤

（山東省醫學科學院附屬醫院普外科，濟南 250031）

目的對兔VX2肝癌模型制作進行改良，以用于介入治療學研究，同時探討瘤灶的CT表現及CT在檢測瘤灶中的作用。方法將VX2瘤細胞接種于兔皮下使其成瘤并傳代；新西蘭兔24只，以改良嵌插法建立移植性肝癌模型，于建模后7、14、21d分別行超聲、CT及血管造影檢查，用于檢測兔肝VX2瘤灶，評估瘤灶生長變化；隨后處死動物，進行尸解，評估影像檢查結果。結果24只（100％）動物以改良嵌插法建立移植性肝癌模型全部成功。瘤灶以種植后2周CT顯示最清楚和典型，直徑1cm～2cm左右，平掃呈低密度或等密度，動脈早期明顯強化，門脈期呈低密度，與周圍肝組織分界較清楚。肝動脈造影顯示腫瘤富血供。而種植后超過3周的腫瘤大部分發生壞死。結論嵌插改良法是一種值得推廣的建立移植性肝癌模型的方法；在對瘤灶進行影像學評價上應盡量選擇CT檢查，接種后1周左右的瘤灶較小而難以觀察；2周左右呈肝動脈源性血供豐富的約1cm～2cm的實體瘤，造影征像為腫瘤血管與腫瘤染色；3周以上瘤灶大多出現明顯示壞死；因此對1～2cm大小的兔VX2肝癌瘤體，最適合行血管造影檢查。

VX2腫瘤；肝癌模型；兔；CT；血管造影

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿，臨床發現往往已到晚期。近年來，隨著肝癌實踐的不斷深入［1］，人們認識到其間存在著許多基礎理論和臨床問題，必須通過進一步的實驗研究來證實和解決，而其中很多研究是利用動物肝癌模型進行的。兔VX2肝癌模型是目前理想的肝癌實驗模型，被廣泛用于肝癌腫瘤發生學、治療學、放射生物學、抗腫瘤藥物藥代動力學及腫瘤影像學等實驗研究。但我們在實驗中發現，制作該模型時經常會出現移植瘤處肝表面及臨近腹壁發生轉移，進而影響實驗結果。我們在實驗過程中對兔VX2肝癌模型的制作方法做了一些探索和改良，并就其影像學進行評價。

1 材料和方法

1.1 動物、瘤株及主要設備

6～8月齡普通級新西蘭兔24只，體重2.0kg～2.5kg，雌雄不限，購自山東省農科院（許可證號SCXK20090013）。VX2瘤細胞株由美國引進。日本阿洛卡超聲診斷儀、德國西門子產64排CT機、大C臂DSA，介入器械：3F微導管及微導絲、自制股動脈導管鞘等。無菌手術在山東省醫學科學院附屬醫院中心實驗室及介入手術室進行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 兔VX2細胞株的制備

將活細胞密度為105～107個/mL的VX2瘤細胞懸液接種于兔大腿內側近腹股溝部位皮下，使其成瘤并傳代，2周左右瘤體可長至（1～2）cm3，手術取出傳代瘤株，將腫瘤包膜剝脫干凈，剔除壞死及纖維組織，取靠近邊緣的魚肉樣腫瘤組織在平皿上剪成約（1～2）mm3的小塊，以生理鹽水反復沖洗，作為瘤種備用。

1.3 瞼板腺囊腫鑷夾持固定瘤塊植入法即改良嵌插法［2］建立移植性肝癌模型

預接種兔經耳緣靜脈先以安定（0.25mg/kg）靜脈注射，隨之氯胺酮（10mg/kg）麻醉后固定，劍突下正中倒v樣小弧型切口長約1cm～2cm打開腹腔，剪除劍突，小拉鉤牽引暴露肝臟。選擇大小合適的瞼板腺囊腫鑷全層夾持肝葉（左中葉）并拖出腹腔外（圖1），力量以阻斷局部血液循環為度，不可用力過大而夾碎肝臟，調整好固定螺絲。在擬接種的手術部位以尖刀刺破肝包膜，深約3mm～5mm，將一瘤塊植入后以小塊明膠海綿封閉創口，壓迫片刻無滲血，表面涂以OB膠，稍后凝固即可撤出瞼板腺囊腫鑷，肝臟還納腹腔，兩層縫合切口。上述操作均在無菌條件下進行，術后青霉素80萬單位肌內注射，連續3d。

1.4 影像學評估和解剖觀察

術后常規喂養，種植后第1、2、3周分別隨機挑取8只實驗兔逐只行超聲、CT及血管造影檢查，用于檢測兔肝VX2瘤灶，評估瘤灶生長變化。隨后空氣栓塞法處死動物，進行尸解。具體做法：依前法先將兔麻醉，耳緣靜脈留置針不拔，以便隨時追加麻藥，腹部備皮。首先行普通超聲檢查。再行CT檢查，選用非離子型對比劑優維顯（Ultravist，300mg/mL），對比劑量為7mL，0.3mL/s，先行肝臟CT平掃，延遲10s～12、40s～50s后分別行動脈早期和門脈期增強掃描，掃描條件為120kV，180mA，FOV 160mm，層厚2mm，間距3mm。然后行血管造影（第2、3周），采用傳統Seldinger法：將實驗兔固定后，腹股溝區備皮、消毒、鋪巾，靠近腹股溝區沿股動脈縱行切開皮膚，暴露股動脈鞘并小心剪開，分離出1～2cm長的股動脈，近遠端分別用4號絲線穿過備用。提起近端絲線，保持適當張力以暫時阻斷血流，用眼科剪在股動脈前壁剪一小“v”形口，將短導絲插入，成功后將自制導管鞘順導絲插入股動脈并向近端送入約4cm，結扎近端備用絲線以固定導管鞘。經鞘管引入3F微導管，尋找到腹腔動脈后行造影，確認肝固有動脈，超選擇性插管至肝固有動脈，再次造影證實肝實質顯影，并可進一步超選擇肝左或肝右動脈進行造影［3-5］。最后是尸解，觀察肝臟成瘤情況、測量腫瘤直徑并與最后的CT檢查結果對比、瘤體內部壞死情況、有無腹壁及其他器官轉移等。

2 結果

2.1 影像學評估

建模術后1周：B超不能發現瘤灶；CT掃描，瘤體較小或者圖像上無法分辨瘤灶。術后2周：瘤體直徑可達1cm～2cm，圖像呈典型實體瘤表現，8只實驗兔中B超發現6只（6/8），CT發現8只（8/8），B超診斷率低于CT（75％對100％）。術后3周：瘤體繼續增大，中央出現液化壞死，呈囊腔表現。B超及CT均能發現瘤灶，診斷率相當（均100％）。

1cm～2cm大小的兔VX2肝癌瘤體，其CT表現與人肝細胞癌相似，平掃圖像呈邊界清楚的低密度結節，與周圍正常肝組織分界清楚，動脈期明顯強化（圖2），因該時期造影征像為腫瘤血管與腫瘤染色，呈肝動脈源性血供豐富的實體瘤，故此時最適合行血管造影檢查；而3周以上瘤灶中央大多出現明顯壞死，染色不明顯，因此不適合行血管造影檢查。

介入操作時除1只因麻醉淺致手術時掙扎，股動脈近心端被導管鞘意外穿破，大出血死亡外，其余均成功插管至肝固有動脈，部分可超選擇至肝左或肝右動脈，插管成功率87.5％。行DSA造影后主要表現為：胃左與肝總動脈共干，肝總動脈向右走行分出胃十二指腸動脈與肝固有動脈，肝固有動脈分為肝左與肝右動脈，肝左動脈較粗，肝右動脈相對較細，膽囊動脈主要由肝右動脈分出。瘤周血管粗大紊亂，有大量細小的異常血管，腫瘤呈均一、結節樣或環行染色，瘤體較大時可見粗大的供瘤動脈被瘤體推壓成“抱球狀”，其外周可見肝左動脈分出的腫瘤滋養血管抵達腫瘤并繞行，密度高且粗大，其分支進入腫瘤內部（圖3）。

2.2 尸檢情況

24只實驗兔全部種植成功（100％）。第1周時一部分瘤灶雖然影像學檢查未能檢出，但尸檢均發現移植瘤成活。瘤灶均位于肝左葉，呈單一團塊狀（圖4），無肝表面及腹壁轉移。第3周時有2只發現肝表面及腹壁轉移，1只發現遠處器官轉移，1只合并有腹水。大體解剖：腫瘤組織呈灰白色結節樣，圓形或橢圓形，與周圍組織分界清楚，剖面呈魚肉狀。測量腫瘤直徑均與CT檢查結果相符。直徑2cm以下的瘤灶多呈實質性，3周后的瘤灶直徑約2.5cm～3.5cm，中央多有液化性壞死灶并形成囊腔。

3 討論

圖1 瞼板腺囊腫鑷夾持肝葉并固定Fig.1 Exteriorizing and fixing the liver lobe，and clamped and compressed with a chalazion forceps.

圖2 VX2肝癌CT表現Fig.2 CT image of the VX2 hepatoma

圖3 DSA造影后瘤體呈“抱球狀”Fig.3 The tumor shows“holding a ball”after DSA angiography

圖4 肝左葉呈單一團塊狀瘤體Fig.4 The tumor is a single mass and located in the middle left liver lobe

兔VX2腫瘤為從Shop病毒在兔皮膚誘發的鱗癌，經數十次傳代建立的兔可移植性腫瘤，接種于肝內的成功率極高，接種成功的肝VX2瘤灶是主要由肝動脈供血的富血供性腫瘤，雖然其病理形態學表現并非肝細胞癌，但已有的研究證明其適合用作于肝癌介入治療的動物模型。

VX2肝癌按接種所使用的瘤種形態可分為：①瘤細胞懸液接種，②瘤組織小塊接種；用于研究原發性肝癌的多用開腹直視下肝實質瘤組織塊接種法，用于研究肝轉移瘤的多用經門靜脈或脾臟瘤細胞懸液注入法。按接種的途徑可分為：①經肝動脈注入接種，②經門靜脈或腸系膜靜脈注入接種，③肝實質接種。肝實質接種方法按手術方式可分為開腹直視下接種和利用影像學方法引導經皮穿剌接種［6］。開腹直視下肝實質接種法又含有開腹直視下肝穿剌注入瘤小塊與局部肝切開瘤小塊包埋法，都屬于嵌插法，不同之處在于植入瘤塊后有的是以明膠海綿塊填塞，有的是縫合肝被膜。以影像學方法引導經皮穿剌接種法屬于微創技術，優點是不需開腹，動物創傷小，但易形成穿刺部位肝以外的轉移，且成功率低。

兔肝臟不易固定，血運豐富，術中容易出血且不易止，致術野不清，操作困難，容易造成移植瘤播散，增加手術難度，我們使用瞼板腺囊腫鑷，取得了理想的效果。瞼板腺囊腫鑷是眼科的一種專用器械，分大、中、小三號。具體方法是在擬接種的手術部位（肝左兩葉呈疊瓦狀排列，選擇左中葉中央）以瞼板腺囊腫鑷全層夾持，力量以阻斷局部血液循環為度，調整好固定螺絲；瘤塊植入后，放置明膠海綿塊，再涂以OB膠，稍后凝固即可撤出瞼板腺囊腫鑷，其他步驟均常規操作。此法優點是出血控制好，術野清除，操作方便，節省人力，不需助手，在整個瘤塊植入操作過程中不至于引起其他部位的轉移。而單純塞明膠海綿在兔清醒后活動或掙扎時，海綿塊往往會因為腹壓的增加而脫出創口，使種植瘤長到肝邊緣、腹壁或者形成遠處轉移，致使下步實驗受影響。而經皮穿剌接種法、開腹嵌插法等因有不可避免的肝出血以及瘤組織相對暴露等原因易形成肝表面、腹壁或者遠處的轉移。我們的結果表明，嵌插改良法是一種值得推廣的建立移植性肝癌模型的方法。

超聲檢查可用于兔肝VX2腫瘤的指導接種、生長觀察、治療后動態變化評估等。采用氟碳聲學造影劑和二次諧波顯像技術進行肝臟腫瘤聲學造影可大大提高超聲對肝腫瘤的觀察能力，腫瘤血管早期增強，可以提高對大于1cm瘤灶的檢出。灌注-延遲顯像聲學造影對直徑5mm～10mm內的腫瘤結節的檢出率可高達90％左右。

CT與MRI可用于檢測兔肝VX2瘤灶，評估瘤灶生長變化。接種后1周左右的瘤灶較小而難以觀察，2周左右時表現典型，3周以上瘤灶大多出現明顯示壞死。VX2肝癌的CT/MRI表現與人肝細胞癌相似，CT平掃多呈邊界清楚的低密度結節，動脈早期明顯強化，門靜脈期呈較低密度與周圍肝組織分界較清楚；MRI T1WI與T2WI分別表現為均勻低信號和稍高信號，增強后瘤灶呈邊緣環狀強化。

血管造影時，由于兔肝血管細小，所能容納造影劑的量很少，常規造影法不易觀察，現在大都采用DSA造影。兔VX2肝癌雖是移植性腫瘤，但血管造影顯示為肝動脈源性血供豐富的實體瘤，主要征像為腫瘤血管與腫瘤染色［5，7］。在介入治療時，必須先行造影證實插管在肝固有動脈內，并盡量超選擇進入肝動脈分支，以避免化療栓塞時造成胃腸異位栓塞、膽囊栓塞、肝臟大面積梗死等嚴重后果。

［1］范上達，邱宗祥，潘冬平.肝癌的綜合治療［J］.中華消化外科雜志，2011，10（4）：241-246.

［2］牛洪欣，徐忠法，王麗麗，等.兔VX2肝癌模型制作技術改良［J］.中國實驗動物學報，2012，20（4）：53-55.

［3］Niu HX，Du T，Xu ZF，et al.Role of wild type p53 and double suicide genes in interventional therapy of liver cancer［J］.Acta Cir Bras.2012，27（8）：522-528.

［4］杜童，牛洪欣，張西坤，等.WTp53基因聯合雙自殺基因介入途徑治療肝癌的實驗研究［J］.中華肝膽外科雜志，2013，19（8）：606-610.

［5］牛洪欣，楊煥剛，張西坤，等.兔肝癌動脈插管介入技術研究［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（9）：1594-1595.

［6］陳勝利，徐兆棟.兔VX2肝癌模型與實驗性肝癌介入治療［J］.現代臨床醫學生物工程學雜志，2003，9（4）：371-377.

［7］Chen JH，Lin YC，Huang YS，et al.Induction of VX2 carcinoma in rabbit liver：comparison of two inoculation methods［J］.Lab Anim，2004，38（1）：79-84.

Improvement in the preparation of rabbit models bearing VX2 liver tumor for interventional therapy study and imaging evaluation

DU Tong，HAN Lin，NIU Hong-xin，ZhANG Xi-kun
（Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences.Jinan 250031，China）

ObjectiveTo improve the preparation of rabbit models bearing VX2 hepatoma for interventional therapy study，and to investigate their CT features.MethodsEighty New Zealand white rabbits were implanted with VX2 hepatoma in the deep aspect of the left lobe of liver.CT scanning was performed in the experimental animals at 1，2 and 3 weeks after implantation.The plain，early arterial phase and portal phase images were obtained.ResultsTwenty-four（100％）rabbits were successfully implanted with VX2 hepatoma in the liver.On CT scans taken at 2 weeks after implantation，the tumors showed most clear and typical images：1-2 cm in diameter，hypodensity or isodensity on plain CT scans，markedly enhanced early arterial phase images，hypodensity on portal phase images，well discernible from the surrounding liver tissues.Hepatic angiography showed that the tumor was hypervascular.Necrosis was seen in most animals at 3 weeks after implantation.ConclusionsThe rabbit model bearing VX2 hepatoma is more suitable for interventional therapy study.CT is very useful in evaluating the tumors.

VX2 hepatoma；Liver cancer model；Rabbit；CT；Angiography

牛洪欣（1972-），男，副主任醫師，醫學碩士，研究方向：消化系統腫瘤。E-mail：sdblache@126.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0029-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.007

山東省醫學科學院資助項目（編號：200944）。

杜童（1974-），女，主管護師，醫學碩士，研究方向：腫瘤外科護理。

2013-11-23