土壤酶和微生物量碳對土壤低濃度重金屬污染的響應及其影響因子研究

線郁,王美娥,陳衛平,*

1.中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室,北京100085;

2.中國科學院大學,北京100039

土壤酶和微生物量碳是土壤生物相活躍的組成成分,是地球物質化學循環和能量轉換的主要參與者,能靈敏地反應土壤質量的變化,是土壤健康狀況的重要微生物指標[1-2]。人類活動引起的土壤重金屬含量升高可能不會改變有機碳含量、總氮含量等土壤化學性質及植物和動物的生理活動,但能夠導致土壤微生物性質發生變化[3-5]。脲酶是參與土壤氮循環的重要土壤酶之一,由于對土壤重金屬污染響應敏感,是土壤重金屬污染生態毒性效應研究的重要指示物,土壤 Ni、Cd、Cu、Zn、Pb、Cr污染均會導致土壤脲酶活性顯著降低[6-8]。微生物量碳的含量約為土壤總有機碳含量的1% ～5%[9-11]。在一個穩定的土壤-植物生態系統中,土壤微生物量碳含量與有機碳含量的比率(MBC/SOC)保持動態恒定;在有外界干擾的情況下,譬如土壤污染、缺水等,MBC/SOC值會發生顯著變化。對城市土壤、農田土壤以及自然土壤的研究發現,重金屬污染會抑制微生物的繁殖從而降低MBC/SOC的值[12-14]。

由于土壤中重金屬的生物有效性與土壤理化性質有關,因此土壤重金屬的毒性效應不僅與重金屬濃度有關,還與土壤性質有關[15-16]。Kizilkaya等[17]的研究發現,農田土壤Cd、Cu、Pb總濃度較低,分別為0.95 ～3.20 μg·g-1,23.05 ～ 96.68 μg·g-1和 76.10 ～ 210.43 μg·g-1時,脲酶活性沒有顯著變化。然而,當土壤Cd、Pb、Zn 濃度分別達到2.4～61.3 μg·g-1,113～7 000 μg·g-1,249 ～12 000 μg·g-1時,土壤重金屬顯著抑制了土壤脲酶活性[11]。Doelman和 Haanstra[8]的研究發現,Cd的半數有效量(ED50值)在砂質壤土中為 30 μg·g-1、砂土中為 120 μg·g-1、泥質壤土中為 520 μg·g-1、黏土中為 520 μg·g-1、沙質泥土中為 490 μg·g-1。Cu的ED50值在砂質壤土中為680 μg·g-1、泥質壤土中為1 990 μg·g-1、黏土中為 1 080 μg·g-1、沙質泥土中為 1 970 μg·g-1。Pb 的 ED50值在砂質壤土中為 1 590 μg·g-1、砂土中為 2 870 μg·g-1、泥質壤土中為 8 130 μg·g-1、黏土中為 1 340 μg·g-1、沙質泥土中為 7 050 μg·g-1。Zn 的 ED50值在砂質壤土中為 290 μg·g-1、砂土中為 110 μg·g-1、黏土中為 90 μg·g-1、沙質泥土中為70 μg·g-1。因此,重金屬對土壤酶的毒性效應還受到土壤性質影響。

本研究擬通過野外監測和實驗室模擬,研究土壤低濃度重金屬污染對土壤微生物性質中脲酶活性和微生物量碳含量的影響及其對土壤理化性質的響應,并從統計分析角度揭示土壤理化性質對土壤重金屬含量與土壤脲酶活性及土壤微生物量碳含量之間的劑量效應關系的影響程度。本研究結果為野外實際評價土壤重金屬污染與土壤微生物性質變化之間的劑量效應關系以及土壤重金屬污染生態風險評價提供基礎數據和方法。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:激光粒度儀Malvern Master Sizer 2 000(Malvern Co.,England),Elementar Vario ELⅢ(Hanau Germany),多功能酶標儀(SPECTRA max190),紫外分光光度計(UV-1700),總有機碳總氮分析儀 Elementar Liqui TOC(Germany)。

試劑:重金屬含量測定及人為添加重金屬時所用試劑為國產優級純;其他步驟所用試劑為國產分析純試劑。

1.2 供試土壤

野外監測選擇北京五環以內建成區為研究區域,采用網格均勻布點法把研究區域分為285個網格,除掉采樣受限制的網格,共采集233個樣點。其中,具有代表性的公園25處,交通區58處,學校等公共場所38處,距市區2 km2以內的農田28處,工業區15處,居民區69處。取樣點均為植被覆蓋的綠地(如草地、林地、草坪和農田),采集表層0～20 cm的混合土壤,陰干,除去土樣中石子和動植物殘體等異物后,分別過2 mm和100目篩備用。

1.3 實驗室模擬試驗

選取3種土壤理化性質有差異的土壤(表1),將過2 mm篩的100g土壤分別放入于250mL錐形瓶中,添加 Cd、As、Pb 濃度分別為 1 μg·g-1、50 μg·g-1、500 μg·g-1(根據我國土壤環境質量標準三級標準設定),保持田間持水量的70%,28℃老化5周。測定土壤蔗糖酶、脲酶、芳香硫酸酯酶、過氧化氫酶、脫氫酶、堿性磷酸酶活性變化。

1.4 化學測定方法

土壤基本性質的測定:土壤質地劃分為粘粒(clay)、粉粒(silt)、砂粒(sand),0.5 mol·L-1NaPO3處理后,用激光衍射系統Malvern Master Sizer 2000(Malvern Co.,England)測定。測定pH的水土比為1:2.5,土樣與去離子水充分混勻,靜置30 min后測定。陽離子交換量(CEC)的測定選擇醋酸銨法[18],蒸餾過程在凱氏定氮儀上完成,再用HCl標準液滴定。土壤有機碳(SOC)的測定選用鹽酸處理法[19],預處理后,使用元素分析儀Elementar Vario ELⅢ(Hanau Germany)測定有機碳含量。

土壤重金屬含量的測定:稱取過100目篩的土壤樣品0.5000 g,用土壤環境監測技術規范(HJ/T 166-2004)中的HCl-HNO3-HF-HClO4法消解土壤。消解產物用1:1王水定容至250 mL,混勻過濾,取濾液用ICP-MS測定Cd和Pb含量;消解產物用1:1王水定容至50 mL,混勻過濾,取濾液用ICP-AES測定Cu和Zn含量。

土壤酶活性測定:蔗糖酶活性測定選用3,5-二硝基水楊酸法[20],生成的3-氨基-5-硝基水楊酸在酶標儀(SPECTRA max190)波長508 nm處比色,酶活性用 mg·葡萄糖(g·12 h)-1表示。脲酶測定選用苯酚-次氯酸鈉比色法[21],生成的NH4-N在酶標儀波長578 nm處比色,酶活性用μg·NH3-N(g·3 h)-1表示。芳香硫酸酯酶活性的測定選用氫氧化鈉-氯化鈣比色法[22],n-硝基酚在酶標儀波長400 nm處比色,酶活性用μg n-硝基酚(g·3 h)-1表示。過氧化氫酶采用紫外分光光度法[23],生成物用紫外分光光度計(UV-1700)在波長240 nm處比色,酶活性用mg·H2O2(g·20 min)-1表示。脫氫酶活性測定選用TTC法[24],生成物在酶標儀波長400 nm處比色,酶活性用ng·TPF(g·15 h)-1表示。堿性磷酸酶活性的測定選用氯代二溴對苯醌亞胺比色法[25],生成物用酶標儀在波長578 nm處比色,酶活性用 μg苯酚(g·h)-1表示。

土壤微生物量碳(MBC)的測定選用氯仿熏蒸浸提法[26],可溶性碳的含量用總有機碳總氮分析儀Elementar Liqui TOC(Germany)測定,KEC取 0.45。

1.5 數據處理

采用SPSS 18.0軟件進行描述性統計分析和相關分析;DPS軟件進行方差分析(ANOVA)和多重比較;Origin 8.0軟件進行擬合。在分析之前,為保證數據的正態分布特性,對測定的Cd、Cu、Zn濃度的原始數據進行自然對數轉換;Pb濃度在進行自然對數轉換后仍不是正態分布,需進行Box-Cox(Minitab 15)轉換,轉換公式為y=x-0.331。

2 結果(Results)

2.1 土壤脲酶活性、MBC含量與土壤重金屬濃度的劑量效應關系

根據Wang等[27]的研究結果,北京市五環內建成區的主要重金屬污染物為Cd、Pb、Cu、Zn,除了少數幾個樣點的重金屬濃度達到土壤環境質量標準二級標準以外,其它大部分樣點的濃度在背景值或以下,且具有空間濃度變化梯度,具體濃度分布見表2。

表1 實驗室模擬所用土壤的理化性質Table 1 Characteristics of soil materials for laboratory simulation experiment

脲酶活性與土壤 Cd、Cu、Zn、Pb濃度劑量-效應關系可以劃分為3種類型(表3)。脲酶活性與土壤Cd濃度的對數呈拋物線關系;與土壤Cu和Zn濃度的對數呈線性正相關關系;與Pb濃度呈冪指數相關,隨著Pb濃度的增加,脲酶活性也增加。在北京五環以內土壤重金屬的濃度范圍內(Cd 0.003～0.98 μg·g-1,Cu 13.4 ～ 207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～ 322 μg·g-1,Pb 4.02 ～174 μg·g-1),土壤中的Cd、Cu、Zn、Pb 對脲酶活性沒有抑制作用。

對MBC、SOC和MBC/SOC與土壤重金屬含量的相關分析表明(表4),土壤MBC含量隨著Cd和Pb的濃度增加而增加,與Cu和Zn的相關性不顯著,SOC濃度隨著4種重金屬濃度的增加都顯著增加,而MBC/SOC隨著Cu、Zn、Pb的濃度增加而顯著降低。以上分析結果表明,與脲酶活性類似,這幾種重金屬對微生物量碳含量的累積并沒有顯著的抑制效應,但是對MBC/SOC比值的變化有顯著影響。已有研究表明,添加污泥而導致的土壤重金屬Cu和Zn的累積會導致土壤MBC/SOC比值降低[28]。城市固體廢棄物填埋也會由于土壤重金屬含量的升高而導致土壤MBC/SOC的比值減小為對照的1/3左右[14]。

MBC/SOC與土壤 Cd、Cu、Zn、Pb 濃度劑量-效應關系可以分為3種類型(表5)。除了與土壤Cd濃度無顯著相關關系外,MBC/SOC與Cu、Zn、Pb的濃度呈顯著負相關關系。因此,在北京五環以內土壤重金屬的濃度范圍內(Cd 0.003 ～0.98 μg·g-1,Cu 13.4～207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～ 322 μg·g-1,Pb 4.02 ～ 174 μg·g-1),土壤重金屬污染打破了土壤微生物量碳和有機碳之間的平衡,且隨土壤 Cd、Cu、Zn、Pb濃度增加MBC/SOC比值減小。

表2 北京市五環以內土壤重金屬濃度(μg·g-1)的統計值(N=233)［27］Table 2 Descriptive statistics on heavy metal concentrations(μg·g-1)of Beijing urban soils inside the 5th ring road(N=233)[27]

表3 土壤脲酶活性［μg·NH3-N(g·3 h)-1］與標準化的土壤重金屬濃度的關系(df=232)Table 3 Relationships between urease activities and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

以上分析結果表明,土壤脲酶活性、MBC/SOC與土壤重金屬的劑量效應關系存在一定的劑量效應關系,但是決定系數均較低,脲酶活性土壤重金屬濃度的決定系數為0.05～0.10(表3),只能解釋變異系數的5% ～10%。MBC/SOC與這幾種重金屬的劑量效應關系大部分的決定系數只能解釋總變異的5% ～6%,與Zn濃度的決定系數最高,但也只能解釋變異的10%(表5)。以上野外監測的數據表明,在北京市建成區區域,土壤重金屬的累積沒有對土壤脲酶產生抑制作用,對于微生物量碳與有機碳之間的平衡有顯著影響,但是影響程度不高。

表4 土壤重金屬含量與土壤微生物生物量碳相關指標的相關性Table 4 Correlation of soil heavy metal concentration and MBC,SOC,and MBC/SOC

2.2 土壤重金屬污染和土壤性質對土壤脲酶活性的單一和聯合效應

土壤因子和重金屬因子單獨和復合效應分析結果表明,土壤中的6種受試土壤酶活性均受兩因素的聯合作用影響(表6,土壤 ×重金屬 p值均小于0.05)。而重金屬的單一作用只對蔗糖酶和脫氫酶活性變化有顯著影響;土壤性質不同導致除脫氫酶以外的5種土壤酶活性都發生了顯著變化。

相關分析表明,土壤脲酶活性與土壤有機質和土壤粘粒含量顯著正相關(表7,r值分別為0.943和0.937),且均達到極顯著水平。但土壤粘粒含量與土壤有機質含量極顯著相關,相關系數達0.999,這與土壤有機質的粒級組成有關,同時也表明兩因子之間存在共線性,為避免模擬過程中引入具有多重共線性的參數,選擇土壤有機質含量進行后面的研究。此外,脲酶活性也與土壤pH顯著負相關(r分別為-0.649),這是因為受試土壤均為堿性土,而pH=6.7是脲酶最適酸堿度。

表5 MBC/SOC與標準化的土壤重金屬濃度的關系(df=232)Table 5 Relationships between MBC/SOC and ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

表6 土壤酶活性受土壤性質和重金屬影響的方差分析Table 6 ANOVA analysis of enzyme activities in heavy metal polluted soils with different properties

表7 土壤脲酶活性［μg·NH3-N(g·3h)-1］與土壤性質的相關分析(n=12)Table 7 Correlation between urease activity and soil property(n=12)

2.3 土壤理化性質對土壤脲酶活性、MBC/SOC與土壤重金屬污染的劑量效應關系的影響

根據表7脲酶活性與土壤性質的相關性分析結果,引入土壤有機質含量(SOC)和土壤pH作為主要的影響因子,對野外監測數據進行進一步的劑量效應關系分析。引入SOC和pH兩個參數后,重新計算的土壤脲酶活性、MBC/SOC與Cd、Cu、Zn、Pb濃度的相關系數為0.14～0.17(表8和表9),增加一倍左右。其中,土壤脲酶活性、MBC/SOC在表征Cd污染時,R2增加均超過10%,表明了這兩種土壤性質對Cd的毒性效應有很大程度的影響。MBC/SOC與脲酶活性相比,決定系數R2增加更多,表明MBC/SOC比土壤脲酶活性對這兩種土壤性質更為敏感。

上述結果也表明,除了土壤重金屬濃度、土壤有機碳含量和pH值,還有未被考慮的因素影響土壤酶活性和微生物量碳對土壤重金屬的響應,所有其它因素的決定系數超過80%。土壤重金屬的毒性效應還受到季節、植被覆蓋以及復合污染的聯合效應等影響。土壤微生物的活性有季節性波動,Zhang等[29]相關研究指出,重金屬對土壤酶的作用在春天和夏天比秋天明顯。植被因素也會影響重金屬對土壤微生物和土壤酶的毒性效應。Yang等[30]的研究指出,植物種類相對復雜的地區土壤脲酶的活性相對較高。重金屬復合效應對土壤酶和微生物的作用也與單一重金屬效應不同,Khan等[31]指出Cd和Pb共存時對土壤酶活性的抑制作用大于單一重金屬。而Wyszkowska等[32]的研究表明單一重金屬Cu對土壤酶的毒性作用大于 Cu 與 Zn、Ni、Pb、Cd、Cr的復合作用。3種重金屬共存時,由于協同作用的影響,對土壤酶的抑制作用要大于單一重金屬[33]。如何綜合并定量化這些因素將是完善土壤重金屬生態風險評價的關鍵。

綜合以上的研究結果表明,土壤酶活性和微生物碳含量受重金屬含量和土壤性質聯合效應的影響。在北京建成區土壤重金屬的含量范圍內(Cd 0.003 ～0.98 μg·g-1,Cu 13.4 ～ 207.9 μg·g-1,Zn 29.4 ～3 22μg·g-1,Pb4.02 ～ 174μg·g-1),土壤重金屬含量只能解釋脲酶活性變化和MBC/SOC變化的5%～10%;通過室內模擬實驗引入土壤有機質含量和pH兩個土壤性質參數后,重新建立的脲酶活性、MBC/SOC與土壤重金屬濃度的相關系數變大,可以解釋總變異的14%～17%。

表8 脲酶活性與土壤性質、標準化重金屬濃度的關系Table 8 Relationships between urease activities and soil properties and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

表9 MBC/SOC與土壤性質、標準化重金屬濃度的關系Table 9 Relationships between MBC/SOC and soil properties and ln(Cd),ln(Zn),ln(Cu)and Pb-0.331in soils

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