孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞生發泡破裂(GVBD)試驗方法的優化及干擾物質篩查

曹閃，樓欽欽，魏無際，秦占芬,*

1.南京工業大學環境學院，南京210009

2.中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京100085

隨著化工業、制造業、農業、醫藥等領域的快速發展，工業原料、重金屬、農藥、藥物等各類化學物質大量排放進入環境。其中一些化學物質具有內分泌干擾作用，可能影響野生動物和人體正常的生長發育。有文獻顯示，目前發現的野生動物種群數量下降[1,2]、性別分化異常[3-5]、雄性精子質量下降[6]、生殖功能障礙[7-11]等可能與內分泌干擾物有關。

非洲爪蟾卵母細胞個體較大、易獲得、操作方便，一直以來廣泛應用于蛋白表達與調節、蛋白功能、離子通道等研究中[12-16]。卵母細胞在成熟前停滯在第一次減數分裂前期，可在體外經孕酮等激素誘導發生生發泡破裂(GVBD)，在卵母細胞動物極出現一個外緣著色較深、邊緣整齊的白色小斑，標志著卵母細胞成熟。GVBD的發生可通過三氯乙酸固定卵母細胞后切開觀察細胞核是否消失來確定。非洲爪蟾GVBD在發育生物學、生殖學研究[17-21]中已有一定應用，由于該過程受激素調節與控制，較容易受到內分泌干擾物的影響，卵母細胞GVBD方法也被嘗試用于內分泌干擾物的研究[22,23]。Pickford等[23]通過GVBD方法篩查[24]發現17α-乙炔基雌二醇也能抑制孕酮誘導的非洲爪蟾卵母細胞GVBD發生。Pickford等[23]基于20次重復試驗的研究結果顯示孕酮誘導卵母細胞發生50%GVBD的濃度范圍為2.5～400 nmol·L-1，且目前用于篩查藥物的GVBD方法暴露時間多選為24 h[22,23]，非洲爪蟾卵母細胞GVBD試驗方法存在著來源于不同個體的卵母細胞對孕酮的敏感性差異過大、暴露時間過長等缺點。

鑒于此，本文擬從減少個體敏感性的差異、提高敏感性、縮短試驗時間等方面，優化非洲爪蟾卵母細胞GVBD試驗方法，選擇甲氧氯作為陽性參照物驗證優化方法，之后應用此方法研究某些化學物質的內分泌干擾作用。Loutradis等[25]研究發現，米非司酮能夠明顯抑制經HCG處理的小鼠排卵，而Pickford等[23]報道米非司酮不影響孕酮誘導卵母細胞GVBD，也就是說米非司酮對排卵的作用還有爭議。Pritts等[26]發現來曲唑在體內可干擾激素的分泌，對卵母細胞的發育有一定的影響。咪鮮胺也是一種可疑的內分泌干擾物，有人報道咪鮮胺與促黃體激素協同促進虹鱒魚濾泡成熟[27]。因此，本研究用優化的非洲爪蟾卵母細胞GVBD試驗研究這三種化學物質的在此過程的內分泌干擾作用。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:眼科剪、鑷子、帶線縫合針、恒溫培養箱(MIR-153,Sanyo,Japan)、培養皿(Corning,USA)、玻璃離心管、體式顯微鏡(SZ660T2L,Optec,China)、搖床(QB-128,Kylin-Bell,China)。

試劑:孕酮(Dr.Ehrenstorfer,Germany)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，煙臺北方制藥有限公司)、咪鮮胺(Fluka,USA)、來曲唑(European pharmacopeia reference standard)、甲氧氯(AccuStandard,USA)、米非司酮(AccuStandard,USA)、HEPES(Sigma,USA)、MS-222(Sigma,USA)、膠 原 酶 (type1A,sigma,USA)、三 氯 乙 酸(Biotopped,China)、青鏈雙抗(Biotopped,China)、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等化學試劑均為分析純試劑，購自北京試劑公司。

1.2 實驗材料

1.2.1 非洲爪蟾及HCG預注射

成年雌性非洲爪蟾飼養于盛有去氯自來水的玻璃缸內，水溫(22±2)℃，明暗光照射周期為12 h:12 h。成蛙每周喂兩次，飼料為豬肝:商品飼料按1:1配比，喂食2 h后換水。試驗前2周，背部淋巴囊預注射100 IU HCG。

1.2.2 溶液配制

OR-2溶液:準確稱量4.797 g NaCl;0.186 g KCl;0.203 g MgCl2·6H2O;1.192 g HEPES混合溶于雙蒸水中，混勻定容至1 000 mL，用1 mol·L-1NaOH 調 pH值至7.4～7.6，高壓高溫滅菌后分裝保存于4℃以備使用。

ND-96溶液:準確稱量5.616 g NaCl;0.149 g KCl;0.200 g CaCl2;0.203 g MgCl2·6H2O;1.192 g HEPES;0.275 g C3H3NaO3混合溶于雙蒸水中，混勻定容至1 000 mL，用 1 mol·L-1NaOH 調 pH 值至7.4 ～7.6，高壓高溫滅菌后分裝保存于4℃以備使用。

膠原酶消化溶液:準確稱量0.15 g膠原酶，溶于盛有10 mL OR-2溶液的玻璃離心管中，配制成10×溶液存放于4℃以備使用。

1.2.3 非洲爪蟾卵母細胞獲取與體外培養

預注射HCG的雌性爪蟾，用MS-222麻醉(若翻正反射消失，說明已經被麻醉);腹部向上平放于托盤上，用酒精棉球擦拭腹部皮膚以消毒，然后用針頭挑起下腹部正中偏右的皮膚，用眼科剪剪開1 cm左右小口，再剪開小口內部肌肉層，即可看到卵母細胞;用鑷子和剪刀小心取出所需量的卵巢小葉，將之放入預先配制好的含有青鏈霉素的OR-2溶液的培養皿中;然后分別縫合肌肉層和皮膚層(注意趕出皮膚層與肌肉層之間的氣泡);最后將爪蟾放于淺水中休息3～4 h，水面不要沒過頭部，待其慢慢恢復體力后放回飼養缸內。取出的卵巢小葉用鑷子撕破包裹在卵母細胞外層的膜性組織，用剪刀剪成20～30個卵母細胞團，此過程應避免剪刀和鑷子刺及細胞造成損傷;用已滅菌的移液管將卵母細胞轉入含有10 mL膠原酶溶液的玻璃離心管中，置于搖床上搖動1 h，再重新更換膠原酶溶液繼續搖動40 min～1 h，此時看到大多數細胞已經分離成單個細胞。除去消化液，用含青鏈霉素的OR-2溶液清洗5～6次，再用ND-96溶液清洗2～3次，轉入含ND-96溶液培養皿中，在顯微鏡下觀察并挑選出表面光滑，無殘留纖維組織及毛細血管的V～VI期卵母細胞，置于培養箱中20℃培養以用于后續試驗。以上實驗操作均在常溫下進行。

1.3 孕酮誘導非洲爪蟾GVBD的時間和濃度優化

孕酮溶于 DMSO中配成 105μmol·L-1儲存液，實驗時用 ND-96 溶液釋成 1 nmol·L-1，10 nmol·L-1，100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-14個濃度梯度，向12孔培養板中分別加入2 mL稀釋后的孕酮溶液，每個暴露濃度設置3個平行孔，每孔隨機放置20個卵母細胞，同時設置DMSO溶劑對照組。之前的文獻報道，暴露時間多采用 24 h，在我們預實驗觀察到經24h，12h，8h卵母細胞的成熟率已經很高，甚至100%，因此我們選擇4 h和8 h來優化方法。在培養箱(18℃ ～22℃)經孕酮誘導4 h、8 h后，觀察并記錄發生GVBD的卵母細胞個數，并用10%三氯乙酸溶液固定確認核是否消失來確認。統計每組發生GVBD的卵母細胞所占的百分比(GVBD%)，同時用概率分析(Probit analysis)計算4 h后誘導卵母細胞發生50%GVBD的孕酮濃度值(EC50)。

1.4 甲氧氯對孕酮誘導GVBD的影響

甲氧氯溶于 DMSO中配成 5×105μmol·L-1儲存液，實驗時用10 nmol·L-1的孕酮溶液(根據計算出的EC50范圍選擇)分別稀釋成 100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-1，10 000 nmol·L-13個濃度，向12孔培養板中分別加入2 mL稀釋后的甲氧氯溶液，每個暴露濃度設置3個平行孔，每孔隨機放置20個卵母細胞，同時設置10 nmol·L-1孕酮作為對照組。在培養箱(20℃)暴露4 h后觀察并記錄發生GVBD的卵母細胞的個數，并用10%三氯乙酸溶液固定確認核是否消失來確認。統計兩次獨立重復試驗非洲爪蟾卵母細胞GVBD%。

1.5 米非司酮、咪鮮胺，來曲唑對對孕酮誘導GVBD的影響

米非司酮、咪鮮胺、來曲唑溶于DMSO中分別配成 105μmol·L-1、106μmol·L-1、106μmol·L-1儲存液，實驗時用10 nmol·L-1孕酮溶液(根據計算出的EC50范圍選擇)分別稀釋成 100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-1兩個濃度，向12孔培養板中分別加入2 mL稀釋后的米非司酮、咪鮮胺、來曲唑溶液，每個處理組設置3個平行孔，每孔隨機放置20個卵母細胞，同時設置10 nmol·L-1孕酮作為對照組。在培養箱(20℃)暴露4 h后觀察記錄，記錄方法如上所述。統計兩次獨立重復試驗非洲爪蟾卵母細胞GVBD%。

1.6 統計分析

用概率分析(Probit analysis)計算EC50。對照組與實驗組的差異采用方差分析(one-way ANOVA)進行統計學檢驗，顯著性水平為p＜0.05，數據分析使用SPSS16.0版本(IBM,USA)。

2 結果(Results)

2.1 孕酮誘導非洲爪蟾GVBD的時間和濃度優化

圖1表示的是經孕酮誘導4 h、8 h后，非洲爪蟾卵母細胞發生GVBD%，數據反映的是來自3只雌性非洲爪蟾的卵母細胞的GVBD趨勢。在不同孕酮濃度(1 nmol·L-1、10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1000 nmol·L-1)經誘導4 h后，非洲爪蟾卵母細胞均發生GVBD現象，GVBD%分別為10.56%、53.89%、85.00%、98.33%;經誘導8 h后，GVBD%分別為25.00%、67.78%、91.67%、98.33%。不同個體來源的卵母細胞經孕酮誘導4 h后的GVBD%結果如圖2所示。實驗結果表明在相同孕酮濃度、相同誘導時間下，不同個體的卵母細胞所產生的GVBD%不同，非洲爪蟾卵母細胞對孕酮的敏感性存在個體差異。基于5次孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞GVBD重復試驗的結果，得到誘導卵母細胞發生50%GVBD的孕酮濃度范圍為5.15 nM～58.70 nmol·L-1。卵母細胞發生GVBD卵細胞形態和細胞核的變化如圖3所示:與GV期相比，GVBD期卵母細胞動物級形成一個白色斑點，白斑周圍著色較深;用10%三氯乙酸固定后切開，發現GV期卵母細胞(未成熟)核保持完整，GVBD期卵母細胞(成熟)核消失，即確實發生了GVBD現象。

圖1 時間對孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響Fig.1 Effect of time on progesterone induced Xenopus occyte GVBD in vitro

圖2 孕酮4h體外誘導非洲爪蟾的卵母細胞GVBD試驗Fig.2 Doses of progesterone induced Xenopus occyte GVBD in vitro after 4 hours

圖3 A:未成熟的卵母細胞(GV期);B:孕酮誘導的成熟的卵母細胞(GVBD期)，動物級出現白斑如圖中白色箭頭所指;C:用三氯乙酸固定后切開的未成熟的卵母細胞細胞核保持完整如圖中白色箭頭所指;D:用三氯乙酸固定后切開的成熟的卵母細胞細胞核完全消失如圖中白色箭頭所指。Fig.3 A:Immature oocyte(GV stage);B:Mature oocyte induced by progesterone(GVBD stage),white spot appeared on the animal pole(white arrow);C:Immature oocyte(GV stage)with intact nucleus(white arrow)was observed after fixing with trichioroacetic acid and cracking open;D:when GVBD occurring,mature oocyte nucleus with disappeared nucleus(white arrow)was observed after fixing with trichioroacetic acid and cracking open.

2.2 甲氧氯對孕酮誘導的非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響

甲氧氯對孕酮誘導的非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響如圖4所示。將孕酮對照組GVBD%設置為100% ，100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1、10 000 nmol·L-1甲氧氯暴露組卵母細胞GVBD%分別為34.93%、11.91%、10.06%，顯示甲氧氯對孕酮誘導卵母細胞成熟具有抑制作用，且隨著甲氧氯濃度增大，抑制作用增強。

圖4 甲氧氯對孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響(*表示與對照組相比差異顯著，P＜0.05)。Fig.4 Effects of various concentrations of methoxychlor on progesterone induced Xenopus occyte GVBD(Statistically significant differences(P＜0.05)between treatment groups and the control are shown as*).

圖5 米非司酮、咪鮮胺、來曲唑對孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響(*表示與對照組相比差異顯著，p＜0.05)。Fig.5 Effects of various concentrations of mifepristone,prochloraz,letrozole on progesterone-induced Xenopus occyte GVBD(Statistically significant differences(P＜0.05)between treatment groups and the control are shown as*).

2.3 米非司酮、咪鮮胺、來曲唑對孕酮誘導的非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響

圖5反映的是米非司酮、咪鮮胺、來曲唑對孕酮誘導的非洲爪蟾卵母細胞GVBD的影響:將對照組GVBD%設置為100%，米非司酮100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1暴露組卵母細胞GVBD%分別為106.67%，97.95%，對孕酮誘導卵母細胞成熟過程沒有顯著影響。咪鮮胺和來曲唑 100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1暴露組卵母細胞GVBD%分別為100.49%、101.14%和97.57%、99.56%，兩種藥物對孕酮誘導卵母細胞成熟過程均沒有顯著影響。

3 討論(Discussion)

有文獻報道[23]，非洲爪蟾卵母細胞對孕酮的敏感性存在很大的個體差異，孕酮誘導卵母細胞發生50%GVBD 的濃度范圍從 2.5 nmol·L-1～ 400 nmol·L-1，而且一般在暴露24h后才會有較高的誘導率。如此大的個體差異會增加結果的不確定性，有相應提高實驗重復次數的要求。Fortune等[28]曾發現，在體外培養非洲爪蟾卵巢組織時用HCG孵育后，孕酮濃度明顯升高。而且，在其它誘導非洲爪蟾排卵的研究中，HCG預注射會大大提高誘導排卵的效率。因此，本研究希望通過HCG預注射處理，提高卵母細胞對孕酮誘導的敏感性，降低個體敏感性的差異。結果我們在預試驗中發現，非洲爪蟾經提前預注射HCG處理，其卵母細胞對孕酮誘導的敏感性大大提高，一定劑量下孕酮暴露12 h，GVBD發生的百分率幾乎到100%。考慮到用非洲爪蟾GVBD試驗檢測化學品內分泌干擾效應時，如果孕酮本身的誘導效應過強可能會掩蓋測試物本身的效應，而且卵母細胞發生GVBD后，如果在培養液中的培養時間過長，卵細胞狀態會變差，影響后續顯微鏡確定GVBD的準確性，因此孕酮和測試物的暴露應該控制在一個相對短的時間。同時，如果暴露時間過短，一些化學測試物可能會因為某些理化性質而不能充分起作用。所以，本研究在設置孕酮誘導暴露時間時，選擇了4 h和8 h兩個誘導時間。結果我們發現，卵母細胞經孕酮誘導4 h后已有相當比例的卵出現GVBD，因此，我們選擇4 h作為暴露時間，將更有利于觀察測試物對卵母細胞從GVBD啟動到完全成熟過程的影響。

在4 h的暴露條件下，我們5次重復孕酮誘導GVBD試驗，定量研究了不同個體對孕酮敏感性的差異。結果發現，孕酮誘導卵母細胞發生50%GVBD的濃度范圍為 5.15 nmol·L-1～ 58.70 nmol·L-1。這一范圍的誘導劑量明顯低于Pickford等[23]研究中的2.5 nmol·L-1～400 nmol·L-1的孕酮劑量，顯示本研究中的非洲爪蟾卵母細胞對孕酮有較高的敏感性，而且個體差異比Pickford等的研究明顯降低。證明HCG預注射非洲爪蟾對孕酮誘導GVBD試驗有重要的意義。

在提高非洲爪蟾卵母細胞對孕酮誘導的敏感性、縮小個體差異、縮短暴露時間方面，對孕酮誘導GVBD試驗進行了優化后，本研究選擇以前報道中可抑制孕酮誘導GVBD的甲氧氯作為參考物質，對方法進行驗證。結果發現，甲氧氯暴露濃度為100nmol·L-1、1 000nmol·L-1、10 000 nmol·L-1時，GVBD%為34.93%、11.91%、10.07%，與Bodart等人[22]得出的甲氧氯暴露濃度為 62.5 nmol·L-1、250nmol·L-1、4 000 nmol·L-1時 GVBD% 為 94.8%、76.35%、32.93%的結果相比，發現本實驗方法下甲氧氯對非洲爪蟾卵母細胞GVBD抑制作用更為明顯，說明本實驗方法可靠且更為靈敏。

來曲唑是一種芳香化酶抑制劑，在體內可干擾生殖激素的平衡，對卵母細胞的發育有一定的影響[26]。研究顯示咪鮮胺在體外可單獨或與促黃體激素協同促進虹鱒魚濾泡成熟，表現出一定的內分泌干擾作用[27]。但在本研究中，這兩種化學物質對孕酮誘導GVBD未產生影響，雖然這兩種化學物質在某些環節上具有內分泌干擾作用，但在GVBD的成熟上沒有干擾作用。

米非司酮是一種抗早孕藥，通過與孕酮受體結合，抑制孕酮作用。Loutradis等[25]曾報道，米非司酮能夠明顯抑制經HCG處理的小鼠的排卵，并認為此現象是米非司酮是通過與孕酮受體結合而影響了卵巢的激素水平而導致的。而本研究中，我們卻未發現米非司酮對孕酮誘導的非洲爪蟾GVBD有明顯的抑制作用。這一結果與Pickford[23]等的報道一致。雖然孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞GVBD是生物學上研究卵細胞成熟過程及其機制的良好模型，但目前對這一誘導機制的認識并不完全清楚。最近Evaul等[29]指出，卵母細胞成熟過程存在激素與受體的交互介導作用，孕酮誘導非洲爪蟾卵母細胞成熟是通過與孕酮受體、睪酮受體(AR)結合而導致的，這種結合作用和孕酮濃度高低沒有關系。本研究中發現的孕酮受體抑制劑米非司酮不能抑制孕酮誘導的GVBD，為Evaul等人的觀點提供了支持。

綜上所述:本文通過提高個體敏感性、縮小個體差異、縮短試驗時間等方面對非洲爪蟾卵母細胞GVBD試驗方法進行了改進，優化后的GVBD試驗方法可用于篩查干擾該過程的環境化學物質，關于非洲爪蟾卵母細胞體外成熟機制及環境化學物質對該過程的影響途徑有待于更深入的研究。

致謝:特別感謝中國軍事科學研究院卓仁恭同學的幫助。

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