草甘膦對GC-1小鼠精原細胞的毒性作用及N-乙酰半胱氨酸的干預效應

曾明,黃婷,易吉平,鐘才高,關嵐,王安,劉新民

1.中南大學公共衛生學院衛生毒理學系,長沙410008

2.長沙市疾病預防控制中心理化檢驗科,長沙410001

現代農業對農藥的依賴性越來越大,草甘膦(glyphosate)作為全球銷量最大的農藥除草劑,在環境中廣泛存在,其對生態環境和人類健康的影響越來越受到人們的關注。據統計在全國化學農藥萬噸級品種中,草甘膦年產量位居第3位。除草劑在施用過程中,僅約有1%作用于靶生物,其余殘留在土壤,或通過間接途徑進入水體,從而影響土壤生物和水生生物,水環境中的農藥可通過食物鏈逐級濃縮,從而導致對水生態系統的危害,最后危害人類健康。調查表明,近年來包括草甘膦等除草劑在內的各種農藥在農田中大量使用,對農田的污染也不斷加大,農田中的泥鰍有絕跡的危險[1]。鄧曉和李雅琦[2]發現草甘膦對土壤微生物的種群數量及土壤中細菌、放線菌和真菌生長速率均具有一定的抑制作用,而且隨藥劑濃度的升高抑制作用逐漸增強。Marek等[3]報道低劑量的草甘膦對水生無脊椎動物水蚤(Daphnia magna)有極大的負面影響。Jasper等[4]研究發現小鼠暴露于除草劑草甘膦(農達)后,肝組織血液的生化指標發生變化并受到氧化損傷。雖然草甘膦是一種低毒農藥,但其中毒病例仍有報道,患者可出現心、肝、肺、腎損害的臨床表現,主要死亡原因是呼吸衰竭、休克及腎功能衰竭[5]。Yousef等[6]報道草甘膦能夠引起雄性新西蘭大白兔體重減輕、性欲下降、射精體積和精液濃度減少,精液初期的果糖及精液重量克分子滲透壓濃度降低,同時伴隨異常和死亡精子增多,并且這種危害具有劑量依賴性。Oliveira等[7]以公鴨為實驗模型,發現暴露于草甘膦能影響AR蛋白、芳香酶的表達和活性,并影響雄性和雌性激素的合成,產生對動物生殖的不利作用。康菊芳等[8]的研究表明草甘膦對小鼠精子產生損害,對哺乳動物雄性生殖細胞具有潛在的誘變危害。草甘膦作為一種廣譜的除草劑,盡管其毒性低,但由于其使用范圍極廣,在土壤中的滲透力強,不僅可導致其在植物、土壤及水體中的殘留,造成生態系統的危害,而且可能危害哺乳動物及人體的健康。因此研究草甘膦對人群及其他生物體的毒性作用尤其是生殖毒性等遠期危害已日益引起重視。近50年來全球范圍內男性精子數目銳減、精子運動能力低下、精子畸形率上升、男性不育癥患者增加以及睪丸癌、前列腺癌發病率上升,被認為可能與人類生活環境中存在大量雄性生殖毒物如農藥污染等有關[9-10]。目前關于草甘膦對哺乳動物雄性生殖細胞的毒性作用機制尚不清楚。本研究通過以GC-1小鼠精原細胞為研究對象,運用體外細胞彗星試驗、細胞毒性及氧化損傷檢測等方法,分析草甘膦對GC-1細胞的毒性作用,并探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)的干預效應,為闡明草甘膦對雄性生殖細胞的毒性作用機制提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞株和受試物

GC-1小鼠精原細胞(GC-1細胞),由中南大學生殖與干細胞工程研究所惠贈。41%草甘膦異丙胺鹽(商品名農達)購自美國孟山都公司。

1.2 培養基和試劑

DMEM高糖培養基、正常熔點瓊脂糖和低熔點瓊脂糖購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;0.25%胰酶、MTT粉劑購自美國Amresco公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)、碘化丙啶(PI)、二甲基亞砜(DMSO)、Tris-Base和曲拉通(Trion X-100)購自美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒和微量丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 器材

培養板和培養瓶(美國 Fisher公司)、CO2培養箱(美國SHELLAB公司);BHC-1300ⅡA2生物安全柜(北京阿爾泰實驗設備有限公司);DYY-Ⅲ-7型電泳儀(北京六一儀器廠);XD-101型倒置生物顯微鏡(美國JONEC公司);Thermo Forma超低溫冰箱(-80℃,美國Thermo公司);MK3型酶標儀(美國Thermo公司);XS-402型熒光顯微鏡(江南光電股份有限公司)。

1.4 細胞培養

從液氮罐中取出保存GC-1細胞株凍存管,迅速放入37℃熱水中,快速將凍存液融化后,然后加入10倍體積37℃預熱含10%(質量分數)胎牛血清的DMEM高糖培養基,1 000 r·min-1離心 5 min,棄上清,用含 10%(質量分數)胎牛血清的DMEM高糖培養基重懸細胞,置于37℃、含5%CO2培養箱中培養,第2天更換新鮮培養基,待細胞密度達到90%時傳代。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 細胞生存率測定(MTT比色法)

取處于對數生長期終密度為5×104個·mL-1的GC-1細胞,以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔培養板中培養24 h后,換成含不同濃度農達的無血清培養液,農達終濃度為 30、60、90、120、150、180、210、240 mg·L-1;并設置NAC干預組:染毒前1 h,加入終濃度為10 mmol·L-1的NAC(通過查閱文獻及預試驗確定),農達染毒濃度為90 mg·L-1;同時設陰性對照組(PBS緩沖液)和空白對照(不含細胞,僅加培養液);每組設8個復孔。細胞處理并培養24 h后,加入10 μL的5 mg·L-1MTT溶液,繼續孵育4 h,每孔再加入100 μL甲臜裂解液,繼續培養6 h,置微量振蕩器振搖10 min,用酶標儀492 nm波長測吸光度值(OD),計算其平均值。細胞存活率計算公式為:細胞存活率=(處理組吸光度值－空白對照組吸光度值)/(陰性對照組吸光度值－空白對照組吸光度值)×100%。

1.5.2 細胞形態學觀察(Giemsa染色法)

取生長良好的GC-1細胞,以1×105個·mL-1傳代于已放入滅菌蓋玻片的6孔板中,待細胞貼壁生長密度至約80%更換為無血清的DMEM高糖培養基,將細胞分為7組,①對照組:加等體積的DMEM培養液;② ～⑥農達處理組:60、90、120、150、180 mg·L-1;⑦NAC干預組:NAC預處理細胞1 h,再加入90 mg·L-1農達。細胞染毒24 h后,按如下流程進行染色及觀察:PBS輕洗細胞爬片3次→95%(體積分數)酒精固定15 min→PBS輕洗2次→Giemsa染色5 min→蒸餾水清洗后晾干→光鏡觀察并分析。

1.5.3 細胞DNA損傷的檢測(彗星試驗)

取生長良好的 GC-1細胞,以1×105個·mL-1傳代于6孔板,待細胞貼壁生長密度約80%時更換無血清的DMEM高糖培養基,細胞分組同1.5.2。細胞染毒24 h后,采用堿性單細胞凝膠電泳法(彗星試驗)檢測細胞的DNA損傷,根據形成彗星細胞的百分率來分析細胞DNA損傷的情況。檢測基本流程:細胞染毒結束,0.25%胰酶(質量分數)消化離心,用PBS制備單細胞懸液(密度調整為1×105個·mL-1)→按照文獻報道的方法[11]制備含GC-1細胞的瓊脂糖凝膠玻片→從所制備的膠板上掀除蓋玻片,將載有細胞的玻片置于4℃預冷的細胞裂解液中裂解2 h→從細胞裂解液中取出載玻片,置于水平電泳槽中,浸泡于電泳緩沖液解旋20 min,室溫下電泳20 min(電壓22 V、電流300 mA)→電泳結束后取出載有膠板玻片,置于放有中和液平皿浸泡30 min,取出晾干→向載玻片上滴加5 μg·mL-1PI染色液50 μL,加蓋玻片染色20 min→在熒光顯微鏡下觀察,隨機選取鏡下細胞拍照,并采用單細胞凝膠電泳圖像分析軟件CASP-1.2.2對細胞圖像進行分析。每個處理組分別隨機分析100個細胞,以彗星陽性率(%)、彗星尾部 DNA%(TD,%)、彗星頭部DNA%(HD,%)、彗星尾長(TL,μm)、尾矩(TM)和 Olive尾矩(OTM)為分析指標。

1.5.4 細胞毒性指標檢測(LDH活性檢測)

細胞傳代及分組同1.5.3。細胞染毒24 h后,分別收集各組培養液,按照南京建成生物工程研究所的LDH測定試劑盒說明書檢測培養上清液中LDH活性。

1.5.5 細胞氧化損傷指標測定

細胞傳代及分組同1.5.3。細胞染毒24 h后用0.25%(質量分數)胰蛋白酶消化并離心(1 000 r·min-110 min),PBS重懸離心2次,棄上清,加入一定量的細胞裂解液,4℃裂解1 h,取細胞裂解液待測。按照南京建成生物工程研究所的考馬斯亮蘭蛋白試劑盒、SOD測定試劑盒、GSH測定試劑盒及微量MDA試劑盒說明書分別測定細胞內蛋白含量、SOD活性、GSH及MDA含量。

1.6 統計分析

實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件分析處理。試驗結果以均數士標準差士S)表示。計量資料采用ANOVA方差分析和t檢驗,計數資料采用卡方檢驗,劑量反應關系采用直線相關分析。P＜0.05表示組間具有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 農達對GC-1細胞存活率的影響

如表1所示,不同濃度農達作用24 h后GC-1細胞存活率降低,且隨處理濃度的增加而下降,兩者存在負相關(r=-0.992,P＜0.01),可見農達對GC-1細胞存活率的影響具有劑量依賴關系。用10 mmol·L-1NAC干預后,90 mg·L-1農達染毒組的細胞存活率明顯上升,干預前后存活率的差異具有統計學意義(P＜0.05)。為能較好觀察農達對GC-1細胞的損傷作用及NAC的干預效應,選取細胞存活率為80% ～40%的處理濃度,即 60、90、120、150、180 mg·L-1以及NAC 干預組(10 mmol·L-1NAC+90 mg·L-1農達)進行后續實驗。

2.2 農達誘導GC-1細胞形態學改變

如圖1所示,光鏡下可見對照組細胞大小均勻,排列有序,細胞邊界清楚,核及核仁完整深染,胞漿淡染;農達處理后,引起GC-1細胞皺縮,細胞密度減少,部分細胞腫大,有空泡出現,隨著農達處理濃度增加,細胞膜和核膜不完整或消失,染色質固縮濃染,細胞成壞死樣改變;NAC干預組(10 mmol·L-1NAC+90 mg·L-1農達)壞死樣細胞比單獨 90 mg·L-1農達處理組明顯減少。

表1 農達對GC-1細胞存活率的影響Table 1 Effect of Roundup on survival rate of GC-1 spermatogonium(GC-1 spgs)

表1 農達對GC-1細胞存活率的影響Table 1 Effect of Roundup on survival rate of GC-1 spermatogonium(GC-1 spgs)

注:* 與對照組相比,P ＜ 0.05;Δ NAC干預組(90 mg·L-1農達+10 mmol·L-1NAC)與90 mg·L-1農達組相比,P ＜ 0.05。Note:*P＜0.05,compared with the control;Δ P＜0.05,10 mmol·L-1NAC+90 mg·L-1Roundup group compared with 90 mg·L-1Roundup group.

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圖1 農達處理24 h后GC-1細胞的形態學變化(40×)注:A.對照組,B.60 mg·L-1農達組,C.90 mg·L-1農達組,D.NAC 干預組(10 mmo·lL-1NAC+90 mg·L-1農達),E.120 mg·L-1農達組,F.150 mg·L-1農達組,G.180 mg·L-1農達組。Fig.1 Fig.1 Giemsa strained image of GC-1 spgs treated by Roundup for 24 h(×40)Note:A.control;B.60 mg·L-1Roundup group;C.90 mg·L-1Roundup group;D.10 mmo·lL-1NAC+90 mg·L-1Roundup group;E.120 mg·L-1Roundup group;F.150 mg·L-1Roundup group;G.180 mg·L-1Roundup group.

2.3 農達誘導GC-1細胞DNA損傷

圖2可見對照組大部分細胞沒有拖尾現象,呈規則的圓形,周圍有光暈;而不同濃度農達染毒組均有部分細胞出現彗星拖尾現象,提示農達可引起GC-1細胞DNA損傷。表2顯示農達處理組細胞的彗星陽性率明顯高于對照組(P＜0.05),且具有劑量依賴關系(r=0.986,P＜0.01);不同濃度農達處理組細胞的TD、TL、TM及OTM值均明顯高于對照組(P＜0.05),而各處理組HD值則明顯低于對照組(P＜0.05)。10 mmol·L-1NAC對90 mg·L-1農達染毒干預后與 90 mg·L-1農達單獨處理組相比,細胞拖尾減輕(圖2D),彗星陽性率明顯下降,TD、TL、TM及OTM值下降,HD值上升(P＜0.05),提示DNA損傷程度減輕。

2.4 農達對GC-1細胞的毒性及氧化損傷作用

圖1 農達處理24 h后GC-1細胞的DNA損傷彗星圖像(40×)注:A.對照組,B.60 mg·L-1農達組,C.90 mg·L-1農達組,D.NAC干預組(10 mmo·lL-1NAC+90 mg·L-1農達),E.120 mg·L-1農達組,F.150 mg·L-1農達組,G.180 mg·L-1農達組。Fig.1 Comet image of DNA damage in GC-1 spgs treated by Roundup for 24 h(×40)Note:A.control,B.60 mg·L-1Roundup group;C.90 mg·L-1Roundup group;D.10 mmo·lL-1NAC+90 mg·L-1Roundup group;E.120 mg·L-1Roundup group;F.150 mg·L-1Roundup group;G.180 mg·L-1Roundup group.

表2 農達作用24 h后對GC-1細胞DNA損傷的影響Table 2 Effect of 24 h Roundup treatment on indicators of DNA damage in GC-1 spgs

表2 農達作用24 h后對GC-1細胞DNA損傷的影響Table 2 Effect of 24 h Roundup treatment on indicators of DNA damage in GC-1 spgs

注:*與對照組相比,P ＜ 0.05;Δ NAC干預組(90 mg·L-1農達+10 mmol·L-1NAC)與90 mg·L-1農達組相比,P ＜ 0.05。Note:*P＜0.05,compared with the control;Δ P＜0.05,10 mmol·L-1NAC+90 mg·L-1Roundup group compared with 90 mg·L-1Roundup group.

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表3 農達對GC-1細胞LDH、SOD活性及MDA、GSH含量的影響Table 3 Effect of Roundup on levels of LDH,SOD,MDA and GSH in GC-1 spgs

表3顯示農達處理24 h后,GC-1細胞的LDH釋放增加,且釋放量隨農達濃度的增加而增加,兩者存在正相關(r=-0.959,P＜0.01);其中≥ 90 mg·L-1的農達各處理組LDH與對照組比較有明顯差異(P＜0.05);NAC干預后90 mg·L-1農達處理組LDH與對照組比較無明顯差異,而NAC干預組與農達90 mg·L-1單獨處理組相比 LDH釋放明顯減少(P ＜0.05)。

表3也顯示農達處理24 h后,引起GC-1細胞內SOD活性降低,GSH含量減少,MDA生成增多,與對照組相比有明顯差異(P＜0.05);各農達處理組中MDA、GSH含量及 SOD活性均有劑量反應關系(MDA,r=0.943,P＜0.01;SOD,r=﹣0.781,P＜0.01;GSH,r=﹣0.943,P＜0.01)。NAC干預組與90 mg·L-1農達單獨處理組相比,SOD活性升高、GSH含量增加及MDA生成量減少,兩組差異有顯著性(P＜0.05);而NAC干預組和對照組相比,SOD活性降低,MDA生成量增多,但無明顯差異(P＞0.05)。

3 討論(Discussion)

細胞膜是種選擇透過性膜,具有維持細胞內環境相對穩定的作用。細胞膜通透性的增大,是化學毒物作用于細胞膜的早期反應,也是細胞損傷的早期表現之一。乳酸脫氫酶(LDH)是胞漿標記酶,在細胞內很穩定,細胞處于正常狀態下其不能通過細胞膜,但當細胞受到損傷或死亡時便可釋放到細胞外,此時細胞培養液中LDH的活性與細胞損傷或死亡數目呈正比。因此LDH漏出檢測是一個敏感的試驗指標,特異性反映藥物、農藥等化學物質引起細胞膜損傷及通透性改變等細胞毒性作用[12]。本研究結果顯示,農達處理GC-1細胞24 h后,光鏡下可見細胞皺縮,細胞密度降低,部分細胞腫大,細胞質出現空泡,隨著農達處理濃度增加,細胞膜和核膜不完整或消失,染色質固縮濃染,細胞成壞死樣改變;細胞存活率也隨著農達處理濃度增加而下降;同時農達處理24 h的GC-1細胞釋放LDH增加,使得培養上清中LDH活性升高,與對照組比較有統計學意義。這些結果提示農達引起細胞膜出現不同程度的損傷,導致細胞膜通透性增加甚至細胞膜破裂、細胞死亡等細胞毒性作用。

正常情況下機體內存在完整的防御系統,細胞中的有關酶類和小分子物質的抗氧化效應可拮抗自由基的氧化損傷效應,從而維持氧化損傷與抗氧化防御體系處于一種動態平衡狀態之中[13]。當細胞遭到外來因素的干擾,氧化與抗氧化系統平衡被影響而發生改變,自由基過度產生或機體的抗氧化防御體系功能受損,過多的自由基導致細胞氧化損傷作用。MDA是細胞發生脂質過氧化反應的產物中具有代表性的產物,其含量的多少可反映自由基產生和脂質過氧化的程度,間接反映細胞內 ROS水平和細胞損傷的程度。細胞內的抗氧化系統中,常采用GSH、SOD來反應細胞內的抗氧化能力。SOD是自由基的有效清除劑,具有防止自由基對機體直接或間接的損傷作用。SOD活力的降低,說明體內需清除的自由基較多[14]。GSH是體內重要的非酶性抗氧化系統中的一種重要內源性分子,在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的催化下,可使體內過氧化物還原為H2O和氧化型谷胱甘肽(GSSG),從而阻斷脂質過氧化的連鎖反應,保護細胞不受氧化自由基的損傷。GSH的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要標志[15]。在本研究中,筆者發現經農達處理24 h后,MDA含量顯著增多,而SOD酶活性與GSH水平均明顯降低,與對照組比較有統計學意義,提示農達可能誘導 GC-1細胞 ROS產生增加,引發細胞氧化應激,從而脂質過氧化產物MDA增多,GSH耗竭及SOD活性降低,引起細胞氧化與抗氧化失衡,導致細胞氧化損傷。

NAC是谷胱甘肽的前體,作為小分子物質,易于進入細胞,脫乙酰基后成為GSH合成的前體,促進GSH的合成,提高組織內GSH含量,增強組織的抗自由基及藥物和毒物損傷能力。此外,NAC還可通過其還原性巰基,直接捕獲未成對電子,阻遏超氧陰離子的生成,并作為谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的底物,可清除具有組織損傷能力的羥自由基和脂肪酰羥基過氧化物,還原氧化型蛋白巰基,維持蛋白質功能,還可通過參與氧化應激基因表達的調控等機制發揮其抗過氧化損傷的作用[16]。本研究結果顯示經NAC干預的90 mg·L-1農達處理組,LDH漏出減少,MDA含量下降,SOD活性增加,GSH水平升高,與90 mg·L-1農達單獨處理組相比,具有統計學意義;結合細胞形態學觀察,可知NAC對農達誘導細胞膜通透性增加及氧化損傷起到一定的保護作用,這與徐德祥等[17]的報道一致。

彗星試驗是一種檢測單個細胞DNA鏈斷裂損傷的電泳技術。由于其操作簡單、快速、靈敏、無需放射性標記、所需細胞少,適用于體內外不同類型實驗和各種類型細胞DNA損傷的研究。本研究通過彗星實驗檢測發現農達可致GC-1細胞DNA鏈損傷斷裂,而且濃度越大,彗星率越高,形成的DNA碎片也越多,拖尾現象更明顯,細胞損傷程度越嚴重。Gasnier等[18]研究也顯示農達能夠誘導人細胞株DNA損傷。通過NAC預處理后農達染毒組彗星細胞較農達染毒組減少,說明NAC對農達誘導GC-1細胞DNA損傷具有一定的保護作用。有研究表明NAC對DNA的保護可能主要通過以下途徑得以實現[19]:①過氧化物會造成DNA損傷,能產生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物,還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷。NAC清除活性氧,抑制環氧合酶COX-1及COX-2的活性,還抑制炎癥和病毒感染引起的脂質過氧化反應。②NAC還可抑制與DNA修復相關的自然突變,修正DNA的去甲基化,保護核酶如PARP及提高對受損DNA的修復。③NAC抑制誘導突變和DNA的損壞,并能抑制化學誘導的細胞轉化。

綜上所述,除草劑草甘膦處理可引起GC-1小鼠精原細胞氧化與抗氧化失衡,造成細胞膜脂質過氧化反應,細胞膜通透性增加,造成細胞氧化損傷和DNA損害,導致細胞損傷或死亡;NAC可能通過抗氧化拮抗草甘膦的毒性。

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