典型水污染區環境樣品的去甲基化表觀遺傳毒性初步研究

朋玲龍,楊永堅,王先良,王菲菲,呂占祿,錢巖,滿江紅

1.安徽醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生系,安徽230032

2.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室,北京100012

環境污染物不僅可以通過損傷人體的遺傳物質導致基因序列改變或染色體畸形,影響重要功能性蛋白的表達進而產生各種健康損傷效應,還可以通過改變受體重要基因啟動子區的甲基化水平來調節功能性蛋白的表達,進而產生腫瘤等各種不良效應,也就是說污染物可以通過下調/上調基因啟動子區DNA甲基化水平影響關鍵基因表達進而產生人體健康損害[1-3]。當一種化合物可以導致人類受體DNA中基因啟動子區甲基化水平等化學修飾改變,但不伴有基因突變等其他遺傳物質損傷時,就可以被認為是一種表觀遺傳毒物[4]。研究發現,環境中存在這樣一大類化學物質,目前被認為是無毒或無害的,卻通過調節DNA甲基化水平對人類產生潛移默化的深遠影響[5],因此,評估化學污染物去甲基化能力是化學品安全性評價的新問題,有專家已經開始認識到定量檢測去甲基化表觀遺傳毒性重要性[6-7],但目前為止還沒有形成比較成熟的方法。

DNA甲基化通過調控基因表達在污染物毒性損害過程中扮演重要角色。不管是體內實驗還是體外實驗,了解化學物對于人類甲基化水平的作用,可以為評估化學物潛在毒性提供更全面的評價信息。近幾年研究顯示,暴露于重金屬等可引起DNA甲基化的改變,如長期低濃度砷暴露所致健康損害與其導致受體遺傳物質DNA去甲基化等表觀遺傳機制有密切聯系[8]。另外鎳、鉻的毒性也與表觀遺傳調控密切相關[9]。而環境樣品如地表水、地下水以及土壤等都含有這類物質,那么我們考慮環境樣品是否也具有去甲基化表觀遺傳毒性,因此選取淮河流域局部癌癥發病關注地區采集的地表水、地下水、土壤和底泥樣品為代表性環境樣品,以其中的2個地表水、3個地下水、2個土壤、2個底泥樣品重金屬提取液為測試樣,通過EGFP方法[10]檢測其去甲基化表觀遺傳毒性,評價結果以去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)的濃度當量表示,5-Aza-CdR是醫學上明確的具有較強去甲基化能力的藥物[11]。該方法是基于EGFP報告基因的分子生物學構建,采用高甲基化的EGFP報告基因受試細胞重組載體,以此為基礎采用評價去甲基化能力的健康風險評價新方法,是對污染物表觀遺傳毒性評價技術的新探索。同時通過電感耦合等離子體質譜法(ICP/MS)[12]對提取液的成分進行掃描檢測分析,探索影響樣品綜合去甲基化能力的主要組成成分。環境樣品中具有去甲基化能力的物質很多,前期研究顯示采集樣品地區存在一定程度的重金屬污染,如Cd、Mn,故這次在探索影響樣品綜合去甲基化能力的主要組成成分時只針對重金屬成分。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器:STD型冷凍干燥機(FTS公司,美國);FED115型電子烘箱(Binder公司,德國);漩渦振蕩器(賽唯斯科技公司,中國);Agilent 7500c型電感耦合等離子體質譜儀(安捷倫公司,美國);水平電泳儀(Biometra,德國);凝膠成像系統(Vilberlo urmat,法國);PCR儀(Biometra,德國);高速離心機(Sigma 3K30,Sigma,美國);流式細胞儀(Bechman Coμlter Altra,美國);CO2培養箱(Thermo,美國)。

主要試劑:HNO3優級純;大腸桿菌感受態細胞、pEGFP-C3質粒由北京工業大學楊怡姝教授饋贈;HepG-2細胞由協和細胞庫提供;Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN,美國);DNA Fragment Purification KitVer.2.0(TaKaRa,中國);CpG甲基化酶(M.SssⅠ),核酸內切酶 HpaⅡ,EcoRⅠ,ApaLⅠ,MspⅠ(New England Biolabs公司,美國);T4 DNA ligase(New England Biolabs,美國);RNeasy Mini Kit試劑盒(QIAGEN,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 環境樣品的預處理

地表水、地下水、土壤、底泥等環境樣品均按照標準操作采樣,4℃運輸和保存。具體點位信息見表1。

水體樣品的前處理方法:取1 mL的水樣,濾膜過濾后直接烘干,再加純水1 mL定容,以該溶液為測試樣分別進行去甲基化毒性測試和ICP/MS檢測;土壤和底泥樣品前處理方法:將土壤和底泥自然風干,后研磨成細粉。取1 g的土壤和底泥細粉分別加入10 mL的10%稀硝酸溶液,漩渦振蕩器混勻3 min,過濾收集濾液,烘干后加入純水1 mL定容,以該溶液為測試樣分別進行去甲基化毒性測試和ICP/MS檢測。

1.2.2 環境樣品去甲基化表觀遺傳毒性檢測

環境樣品表觀遺傳毒性檢測方法參照文獻[10]采用EGFP方法,該方法主要研究化學物去甲基化能力方面的綜合表觀遺傳毒性,基本原理為將pEGFP-C3質粒通過人工甲基化處理獲得熒光蛋白基因啟動子區處于高甲基化狀態的C3質粒,并將其轉染進人類HepG-2肝癌細胞株,隨后以該改造細胞株(EGFPHepG2)為主要工具載體,與受試化學物進行共培養,依據細胞綠色熒光強度來定量評價化學物的去甲基化功能的強弱。

其主要步驟如下:

(1)C3質粒大量制備與甲基化處理

依據常規方法擴增環狀C3質粒,借助核酸內切酶ApaL I和EcoR I雙酶切將C3質粒切割為長片段L和短片段S,其中短片段S中含有GFP蛋白基因的啟動子序列,利用甲基化酶MSss.Ⅰ對短片段S進行人工甲基化處理[13]。反應體系為:10×NE緩沖液2,4 μL;100 × SAM,4 μL;DNA(1.7 μmol·L-1),8 μL;M.SssⅠ,6 μL;ddH2O,18 μL;總量 40 μL;混勻,37 ℃,3 h 溫育。產物 DNA 濃度為 0.36 μmol·L-1。65℃,20 min 滅活M.SssⅠCpG甲基化酶,分裝冷藏保存。利用T4DNA連接酶把成功甲基化的C3質粒短片段S和長片段L重新連接成環,利用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0對重組C3質粒進行純化備用。

(2)甲基化C3質粒轉染HepG-2細胞

快速將所凍存HepG-2細胞40℃水浴搖床60 r·min-1慢搖至其溶解,溶解后馬上轉入37℃水浴箱,手工慢搖恒溫2～3 min復蘇。復蘇后800 r·min-1離心5 min,吸去上清加入10 mL含15%胎牛血清DMEM培養基,混勻后加入24孔細胞培養板,每孔0.5 mL,5%CO2溫箱37℃培養。在豐度達到95% ～100%時在4個24孔板上進行細胞傳代,24 h后細胞貼壁,依據說明書加入Fugene HD轉染試劑和甲基化C3質粒進行轉染[14]。

(3)改造細胞株(EGFPHepG2)與受試物進行共培養

轉染6 h后,開始進行受試物染毒,受試物即在淮河流域局部癌癥發病關注地區采集的2個地表水、3個地下水、2個土壤、2個底泥樣品重金屬提取液。并以5-Aza-CdR為陽性受試物進行細胞梯度劑量共培養染毒處理,通過預實驗確定的梯度濃度為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1,每個梯度設3 個平行孔,每孔依次加入相應梯度的應用液,以制作標準曲線。在染毒過程中為減小5-AZA應用液對細胞生長狀態影響,配制的5-AZA 應用液的濃度分別為0.008、0.04、0.2、1 μmol·L-1,其培養的終體積為1 mL,故每孔只需加相應濃度的5-AZA應用液20 μL。

表1 環境樣品具體點位信息Table 1 Information of the specific point of environmental samples

(4)共培養細胞綠色熒光檢測

通過預實驗發現共培養24 h后細胞可以穩定地發出較強的熒光,故對處理后的24孔板進行攝片,每孔隨機取10個視野,拍攝10張熒光照片,攝片于半小時內完成。

(5)流式細胞儀熒光檢測

拍攝完成后收集24孔板內細胞,加入200 μL消化液消化1 min,加入0.5 mL PBS吹打均勻,吸取到離心管中離心1 200 r·min-14 min,小心去上清液。1 mL PBS重懸細胞沉淀,輕輕吹打均勻,過300目濾網到流式專用管中,放入流式細胞儀測量檢測,獲取其熒光強度。

(6)樣品重金屬提取液去甲基化毒性評價

基于每個受試樣品與細胞共培養后流式細胞儀檢測數據,依據標準曲線對受試樣品的去甲基化表觀遺傳毒性進行評價,每個受試樣品取5個同步平行樣,評價結果以5-Aza-CdR的濃度當量表示。

1.2.3 基于5-Aza-CdR染毒標準曲線的制作

對梯度終濃度為 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1的5-Aza-CdR溶液對受試細胞體系進行了染毒處理,依據上述方案進行了流式熒光檢測,每個濃度梯度設置4個平行測試樣,同時設置了2個完全無甲基化的 C3質粒轉染的對照細胞孔。以5-Aza-CdR溶液濃度為自變量,以熒光陽性細胞百分比為因變量進行擬合,得出甲基化能力測試曲線方程為y=0.136Ln(x)+7.691,其曲線擬合情況見圖1。

1.2.4 環境樣品重金屬提取液成分檢測

重金屬提取液成分檢測參照文獻[12]采用電感耦合等離子體質譜法(ICP/MS)進行檢測分析。

1.2.5 統計方法

數據采用SPSS for windows 10.0進行均數檢驗、相關分析等統計處理,細胞熒光圖片處理采用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件,曲線擬合采用Excel軟件。

2 結果(Results)

2.1 不同樣品測試組細胞熒光

通過熒光顯微鏡對染毒細胞進行攝片,發現不同樣品組之間細胞存在明顯的熒光差異,代表性熒光圖如圖2所示;流式細胞術定量檢測顯示不同樣品的熒光強度也不同,代表性的綠色熒光流式細胞檢測效果如圖2所示。

圖1 5-Aza-CdR染毒的標準曲線Fig.1 5-Aza-CdR exposure standard curve

圖2 代表性顯微鏡綠色熒光攝片及流式細胞綠色熒光檢測效果Fig.2 Representative radiograph by green fluorescence and detection effect on green fluorescence of flow cytometry

2.2 環境樣品的表觀遺傳毒性檢測結果

通過檢測,發現在9個測試樣中,有7個顯示出可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性,占測試樣品78%。其去甲基化表觀遺傳毒性當量介于0.065～0.257 μmol·L-1的 5-Aza-CdR 之間。來自安徽宿州涌橋的一個底泥樣品毒性最高,毒性當量為0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR;并且其一個地下水樣品的毒性較高,毒性當量為 0.142 μmol·L-1的 5-Aza-CdR;在 4 個土壤或底泥樣品中,有3個被檢測出具有可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性,詳見表2。

2.3 環境樣品重金屬提取液成分檢測結果

環境樣品重金屬提取液成分檢測分析發現,共檢測到18種元素,在9個測試樣中錳、鋇、硼、鈦、鈷的檢出率為100%,4個土壤或底泥樣品中除了硒和鈹未檢出外(其中一底泥樣品對硒也有檢出),其余16中元素均有檢出;毒性當量最高的為0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR的安徽宿州涌橋的底泥樣品重金屬檢測發現,這個樣品中Cd的濃度為1.62 mg·Kg-1,超過土壤中的標準限值1.00 mg·Kg-1;其中毒性較高毒性當量為0.142 μmol·L-1的5-Aza-CdR的地下水樣品,檢測發現其中的Mn的濃度為4868.87 μg·L-1,超過土壤中的標準限值300 μg·L-1;在3個被檢測出具有可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性土壤或底泥樣品中,檢測發現存在不同程度的Cd超標。環境樣品表觀遺傳毒性檢測結果也與環境分析結果具有基本一致的趨勢,詳見表3。

表2 典型環境樣品相關信息及重金屬提取液的表觀遺傳毒性評價結果Table 2 Related information on typical environmental samples and evaluation on epigenetic toxicity of extraction of heavy metals

表3 環境樣品重金屬提取液成分檢測結果Table 3 The test result on ingredients of heavy metals extraction in environmental samples

3 討論(Discussion)

環境保護的終極目標是優化環境質量,規避人群健康風險。到目前為止,我們采取了環境標準的策略來保護環境質量。但是,單項因子的達標能否為我們安全的生活環境提供切實的保障,是當前很難做出明確回答的科學問題。由于污染物的生物富集和放大,低濃度污染的復合效應存在,即使單項因子達標,也不能保障暴露人群免于受到環境污染的健康危害。開展環境介質的毒性效應綜合評價是未來環境污染管理不可避免的關鍵科學問題。到目前為止,已經開展的健康危害評價涵蓋急性毒性評價、慢性毒性評價等方面。慢性毒性評價包括致突變、致畸性、致癌等,其與環境污染更為密切,對于環境保護和環境管理的意義更為重要。新近研究發現,在傳統關注的“三致”等健康危害之外,以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性更應該得到足夠重視,因為這種新型的表觀遺傳毒性在環境中更為廣泛,比“三致”毒性更容易出現[15]。事實上,國際上有專家已經開始認為以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性成為了環境污染物對人體健康危害的最前沿,是環境與人體交互作用的第一站[16]。

淮河流域地跨河南、安徽、江蘇、山東四省,既往污染嚴重[17],當地局部人群的癌癥發病較多[18],當地群眾對淺層地下水系安全也非常關注。我們的表觀遺傳毒性檢測結果顯示淮河流域局部癌癥發病關注地區的環境樣品去甲基化能力值得關注,就本研究采集的環境樣品而言,大多數環境樣品去甲基化能力較強,具有不容忽視的表觀遺傳毒性。樣品提取液成分掃描檢測結果顯示,一個地下水樣品Mn超標,4個土壤或底泥樣品不同程度的Cd超標,當地局部地區確實存在一定程度的污染,這與表觀遺傳毒性檢測結果相符,且隨著污染物濃度的提高其去甲基化表觀遺傳毒性有上升的趨勢,運用EGFP方法能夠快速檢測出具有可觀察到去甲基化表觀遺傳毒性的環境樣品。那么多種污染物的復合健康效應是否嚴重,長期生活在這種環境下是否能導致人體關鍵基因啟動子DNA的顯著去甲基化都不清楚,而這種毒性對人體健康有多大影響也尚不清楚,有待我們去進一步研究。

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