急性毒性藻紅外測試中聯合作用評價法的重現性

郭蔚華,錢建偉,吳玉龍,楊誠

重慶大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶400045

急性毒性藻紅外測試中聯合作用評價方法是新技術急性毒性藻紅外測法的核心技術[1],該技術的穩定性將影響其應用前景,在應用之前必須認識其穩定性,而測試其重現性就是評價該技術穩定性的重要依據,因此開展急性毒性藻紅外測試聯合作用評價方法的重現性研究非常必要。目前,國內外進行了急性毒性藻紅外測試中敏感藻的確定方法[2]、藻紅外輻射測試環境重金屬急性毒性[3]、藻紅外輻射測試環境農藥殘留急性毒性[4]、藻紅外輻射測試環境有機毒害物急性毒性[5]、急性毒性藻紅外測試中聯合作用的評價方法[1]、藻紅外測試多元有機毒物急性毒性的初步分析[6]等研究,有關藻紅外測試聯合作用評價方法的重現性研究尚未見國內外報道。為此,開展了藻紅外測試聯合作用評價方法的重現性研究實驗。

本文通過測試敏感藻(月牙藻[2])對5種有機藥品不同組合的響應溫差,用聯合偏差系數法[1]分析聯合作用類型的重現性,評價藻紅外測試聯合作用評價方法的穩定性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

供試藻:羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)[2]作為測試用的敏感藻,由中國科學院武漢水生生物研究所提供。

供試藥品:苯(C6H6)、甲苯(C7H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3),均為國產分析純藥品。

儀器設備:紅外線測溫儀,型號ST60,靈敏度0.1℃;LRH-250A生化培養箱;MOTIC BA200數碼顯微鏡;80-2臺式電動離心機;DR/5000U分光光度計等。

1.2 實驗方法

測試原理:微型藻類具有光合磷酸化和氧化磷酸化的能量代謝系統,對毒害物質急性毒性響應的能量變化強于非光合微生物,微量毒物滴入藻液引起的藻能量變化可被紅外測溫儀測試。

重現性:用相同方法,同一試驗材料,在不同的條件下獲得的單個結果之間的一致程度。不同的條件指不同操作者,不同設備,不同實驗室,不同或相同的時間[7]。

測試藻量標準及用量:葉綠素a作為測試藻量標準,對數生長期供試藻液葉綠素a≥4.0 mg·L-1,此時藻液用于測試[8],供試藻液5 mL。

測試環境:室內,自然光照,20～28℃。

測試容器:直徑4 cm、高3 cm、厚0.2 cm的透明絕熱塑杯。

測試用藻液量:當羊角月牙藻液處于對數生長期,且葉綠素a≥4.0 mg·L-1時,取藻液5 mL用于測試。

實驗組設計:設加藥組和對照組,各組3個重復,加藥組所加藥品分別為5種有機試劑按二元、三元、四元、五元等量混合的26個組合,各組合總藥品量10 g·L-1。

藥液配制:各加藥組藥液的單藥量以總藥品量除以元數計算得出:二元為5.0 g·L-1,三元為3.3 g·L-1,四元為 2.5 g·L-1,五元為 2.0 g·L-1。

測試方法:取培養好的藻液按每個容器5 mL,分別加入加藥組和對照組的測試容器中,待藻液溫度穩定后用紅外測溫儀對準藻液面中部測溫記錄,然后加藥組、對照組分別滴加配制藥液、蒸餾水各0.05 mL,立即對各藻液測溫記錄,每1.5 min測一次,連測8次,至10.5 min結束測溫,取最大響應溫差進行分析。

溫差分析:根據每組測試溫度,先計算出加藥組和對照組的平均測試溫度,再計算其最大響應溫差(試驗藻對毒物的響應溫差)。

式中:Tp—加藥組加藥后測試的平均溫度,Tp0—加藥組加藥前測試的平均溫度,Tw—對照組加空白水后測試的平均溫度,Tw0—對照組加空白水前測試的平均溫度。

聯合作用分析:用聯合偏差系數法評價聯合作用類型[5],即:

式中:θ—混合毒物引起敏感藻響應溫差的聯合作用系數;T—混合毒物引起敏感藻產生的絕對平均溫差;TA、TB、TC…—混合毒物中單一毒物引起敏感藻產生的絕對平均最大溫差。

(θi—聯合偏差系數;f—總均偏差系數,f=0.06;TФ—毒性效應最強藥品產生的溫差;Tβ—聯合作用溫差;Tλ—相加作用的溫差;f·Tλ—偏差溫差)

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 重現性閾值

將溫差偏差實驗測試分析結果整理成表1[5],相加作用在1±f內的重現性為67%,以該數值作為藻紅外聯合作用重現性評價的閾值(Q)。

表1 溫差偏差實驗測試分析結果［5］Table 1 Experiments of temperature difference test and analysis

實驗用苯(C6H6)、甲苯(C6H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3)和羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)進行重現性實驗,以藻紅外聯合聯合偏差系數法評價5種有機物對于羊角月牙藻的聯合作用類型,并分析其重現性,重現性≥Q,穩定性好,重現性＜Q,穩定性差。分析結果整理為表2。

2.2 不同組合的平均重現性

二元組合的重現性:5種藥品10個二元組合中,平均重現性為62.5%,小于閾值Q,表明二元聯合作用的重現性差。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 組合的重現性較好,2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 組合的重現性差,較好與差各占50%。

三元組合的重現性:5種藥品10個三元組合中,平均重現性為75%,大于Q,表明三元聯合作用的重現性較好。其中,3-10組合的重現性差,3-6組合的重現性很好,其余組合的重現性較好,差、很好、較好的比例為10%、10%、80%。

四元的重現性:5種藥品5個四元組合中,平均重現性為85%,大于Q,表明四元聯合作用的重現性好。其中,4-3組合的重現性差,4-1組合的重現性較好,4-2、4-4、4-5組合的重現性很好,差、較好、很好的比例為20%、20%、60%。

五元的重現性:5種藥品1個五元組合中,重現性為100%,大于Q,表明五元聯合作用的重現性很好。

表2 5種有機毒物對羊角月牙藻的聯合作用Table 2 Toxicity effects of five organic matters to Selenastrum capricornutum

上述分析中,重現性大于閾值的組合有19個,占26組合的73.1%。

2.3 聯合作用的重現性變化

二元的重現性變化:由圖1可知,拮抗的重現性在50% ～75%之間。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 的拮抗重現性為75%,較好,其獨立、相加的重現性為25%,較差;2-10拮抗的重現性是50%,其獨立、協同的重現性各為25%;2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 的拮抗或獨立或相加的重現性各為為50%。

三元的重現性變化:由圖2可知,拮抗的重現性50% ～100%之間,獨立的重現性在0% ～50%之間。其中,3-10拮抗的重現性50%,3-6拮抗的重現性100%,其余8組合拮抗的重現性為75%。

四元的重現性變化:由圖3可知,拮抗的重現性在50%～100%之間,獨立的重現性在0% ～50%之間。其中,拮抗的重現性4-3為50%,4-1為75%,4-2、4-4、4-5 為100%。

五元藥品的重現性變化:拮抗的重現性為100%。

上述分析可知,①二元組合中,盡管拮抗的重現性較好,但聯合作用類型多樣,②三元、四元、五元組合中,盡管拮抗的重現性較好,但聯合作用類型減少。聯合作用類型多樣化與混合藥品的元數高低成反相關的情況,尚待進一步分析。

2.4 藥品組合元數增減的重現性變化

根據表2所作圖4可知,聯合偏差系數法評價平均重現性分別是,二元62.5% ＜三元75% ＜四元85%＜五元100%,表明藥品組合元數的增減與聯合作用的平均重現性正相關。

2.5 聯合作用類型數的變化

5種藥品的26個組合中,除了2-10出現3種聯合作用類型(表2),其余每種組合4次測試出現兩種聯合作用類型,聯合作用的4種類型未在同一組合同時出現,聯合作用3種類型只在1個組合(2-10)中同時出現,表明聯合作用類型的重現性是相對的。

從以上結果分析可以得到:

(1)在實驗藥液濃度測試中,重現性大于閾值的組合19個,占26組合的73.1%,聯合作用的重現性較好,總平均藻紅外聯合作用評價法用于有毒有害物聯合作用分析具有較好的穩定性。

(2)藥品組合元數高低與聯合作用的重現性正相關,即藥品組合元數增加,聯合作用的重現性增加,而與聯合作用類型多樣化反相關,其原因有待進一步研究。

(3)聯合作用多種類型可在同組合的不同測試中出現,表明較好聯合作用類型的重現性(總平均重現性73.1%)是相對的,急性毒性藻紅外測試中聯合作用評價方法的穩定性也是相對的。

圖1 二元組合重現性Fig.1 Reproducibility in combinations of two drugs

圖2 三元組合重現性Fig.2 Reproducibility of the combinations of four drugs

圖3 四元組合重現性Fig.3 Reproducibility of the combinations of four drugs

圖4 各元組合的平均重現性Fig.4 Average reproducibility of the combinations

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