固定化酵母重復發酵性能調控

張小玲,李 文,王靖楠,阮馨怡,孔海南,林 燕*(.長安大學環境科學與工程學院,陜西 西安7006；.上海交通大學環境科學與工程學院,上海 0040)

固定化酵母重復發酵性能調控

張小玲1,李 文1,王靖楠1,阮馨怡2,孔海南2,林 燕2*(1.長安大學環境科學與工程學院,陜西 西安710061；2.上海交通大學環境科學與工程學院,上海 200240)

以 2.5%海藻酸鈉(w/v)、2%氯化鈣(w/v)、2%菌體添加量(w/v,細胞干重)包埋固定釀酒酵母,通過增殖活化和批次短周期發酵對固定化粒子的發酵性能進行調控,減緩循環發酵中固定化粒子發酵性能的退化,同時利用掃描電鏡(SEM)對固定化粒子的結構和酵母細胞分布情況進行表征.結果表明:調控后,固定化粒子在葡萄糖濃度為80g/L,pH 4.0,35℃的條件下發酵,發酵性能得到明顯改善.調控前,連續3批次發酵,平均乙醇生產強度為0.33g/(L·h);調控后,批次發酵周期由72h縮短為24h,連續5批次發酵,平均乙醇生產強度提高至1.22g/(L·h).

生物燃料；發酵；海藻酸鈉；釀酒酵母；固定化

以秸稈類木質纖維素為原料生產燃料乙醇,不但能開發清潔高效的替代性能源,而且也有效降低了焚燒等傳統處理方式帶來的環境污染[1-3].傳統的乙醇發酵工藝中,酵母細胞處于游離狀態,細胞密度低,并且難以循環利用[4],固定化酵母發酵制取燃料乙醇,具有與產物分離相對容易、可重復利用、抵抗污染能力強、單位體積細胞密度大、通過填充床反應器容易實現連續化生產等優勢[5-6].其中包埋固定法操作簡單、對細胞活性影響較小、效率高,是目前細胞固定化研究和應用中采用最廣泛的方法[7-9],但隨著固定化酵母的重復利用,部分菌體逐漸喪失發酵能力,以及固定化粒子細胞的泄漏,使系統的發酵性能逐漸下降.因此,減緩固定化酵母發酵性能的下降,改善固定化酵母發酵性能顯得至關重要.

近年來,國內外學者對海藻酸鈣固定化粒子發酵性能的改善主要集中在兩個方面.一方面,對海藻酸鈉進行改性,Inal等[10]將乙烯基吡咯烷酮(N-vinyl-2-pyrrolidone)嫁接在海藻酸鈉上,改性后,最大乙醇濃度和乙醇生產強度分別達到69.86g/L、8.71g/(L·h);賀江等[11]以CaCO3、明膠、硅藻土、瓊脂為添加材料對固定化顆粒的特性進行了改進,并對固定化粒子的發酵穩定性和貯藏特性進行了探索.另一方面,將固定化粒子填充柱反應器與膜提取技術相耦合,解除乙醇對固定化酵母的抑制,Ding等[12]采用PDMS滲透汽化分離發酵醪中乙醇,連續發酵 250h,乙醇生產強度為9.6g/(L·h).通過對海藻酸鈉改性,固定化粒子發酵性能雖得到改善,但無疑增加了固定化成本和操作的復雜性.此外,膜組合工藝雖能解除抑制,但膜的成本較高,且存在堵塞、膜污染等問題.本研究在傳統海藻酸鈉包埋法的基礎上,通過增殖活化、批次短周期發酵對海藻酸鈣固定化粒子發酵性能進行調控,改善固定化粒子發酵性能,減緩循環利用過程中發酵性能的退化,并對發酵前后固定化粒子的結構和酵母細胞分布情況進行對比分析.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種:釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4742(-80℃保存,上海交通大學環境科學與工程學院生物實驗室).菌種在低溫保藏過程中處于休眠狀態,在發酵前須進行活化[13],然后采用稀釋平板法分離純化[13-14],達到對菌種復壯的目的.

活化、增殖培養基:YEPD 液體培養基, pH4.0～5.0.

平板培養基:10g/L酵母膏,20g/L蛋白胨, 20g/L葡萄糖, 20g/L瓊脂粉.

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的擴培 酵母菌復壯后接種于增殖培養基,37℃恒溫搖床180r/min振蕩培養14～16h.擴培的酵母在 3000r/min條件下離心 5min,棄上清液,加入適量無菌水,混勻,重復上述離心操作,直至上清液澄清.

1.2.2 酵母菌的固定化 蒸餾水溶解定量海藻酸鈉,121℃滅菌 25min,冷卻至室溫,無菌條件下,將酵母菌懸液(菌體濃度采用分光光度法檢測[15])與海藻酸鈉溶液混合均勻,形成 2.5%(w/v)海藻酸鈉、2%(w/v)酵母菌懸液,以2%(w/v)的氯化鈣為成形劑,采用滴落法(醫用滅菌注射器,配有 7#針頭)制備固定化粒子[16-17],置于4℃冰箱過夜,備用.

1.2.3 固定化酵母重復發酵 固定化粒子于4℃過夜硬化后,按一定濃度的葡萄糖(80g/L)、營養液[15]配制發酵液500mL,置于自動厭氧發酵罐(上海保興生物設備有限公司)內進行發酵,設置發酵參數:pH4.0,溫度為35℃,轉速為120r/min,固定化粒子投加量 10%(v/v,排水法測定固定化粒子體積,50mL固定化粒子含干酵母1g).

固定化發酵系統前一批發酵結束后,停止攪拌,固定化粒子通過自由沉降即可實現與發酵醪液快速分離,將發酵醪棄去,用無菌水清洗固定化粒子3次,添加與第1批次發酵相等的新鮮發酵液,在相同的發酵參數下共循環發酵3批次,每批次發酵72h,每隔24h取樣,測定發酵醪中葡萄糖濃度和乙醇濃度.

1.2.4 增殖活化固定化酵母重復發酵 取 4℃過夜硬化的固定化粒子50mL,添加0.1%CaCl2、10%(v/v,固定化粒子/增殖培養基)增殖培養基對固定化酵母增殖活化 10h后,用無菌水清洗固定化粒子3次,添加500mL發酵液,重復發酵3批次,每批次發酵72h,每隔24h取樣,測定發酵醪中葡萄糖濃度和乙醇濃度,發酵條件與未增殖活化固定化酵母發酵條件相同.

1.2.5 批次短周期發酵 取 4℃過夜硬化的固定化粒子 50mL,按上述步驟增殖活化后,添加500mL發酵液,重復發酵3批次,每批次發酵24h,每隔 24h取樣,測定發酵醪中葡萄糖濃度和乙醇濃度,發酵條件與未增殖活化固定化酵母發酵條件相同.

1.3 分析方法

1.3.1 發酵基質、發酵產物濃度檢測 葡萄糖(基質)、乙醇濃度(產物)采用高效液相色譜(HPLC,Waters 2707-1515-2414)測定,示差折光檢測器,檢測溫度 45℃,色譜柱使用 Aminex HPX-87P(Bio-rad,USA),帶保護柱,柱溫 85℃,流動相為超純水,流速0.6mL/min,進樣量20μL. 1.3.2 乙醇得率 葡萄糖發酵產乙醇的化學方程式如公式(1)所示,理論上,1g葡萄糖經產生0.51g乙醇.本研究中定義乙醇得率(Y)為乙醇發酵過程中,產生乙醇的量與理論產量的比值,如公式(2)所示

1.3.3 固定化粒子菌體包埋量測定 0.1mol/L pH5.5檸檬酸--檸檬酸鈉緩沖液溶解固定化粒子后,血球計數法測量細胞數.

1.3.4 固定化粒子掃描電鏡(SEM)分析 將

固定化粒子置于 2.5%的戊二醛溶液中固化過夜,乙醇梯度脫水,每次 1h,將顆粒剖開,導電膠粘牢,用掃描電鏡(Sirion 200, Holland)觀察顆粒表面和內部結構,以及酵母細胞分布情況.

2 結果與討論

2.1 固定化粒子重復發酵性能分析

根據本課題組前期研究結果,游離釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae BY4742)最優發酵條件為[18-19]:葡萄糖濃度80g/L,pH4.0,溫度35℃,酵母菌濃度 2g/L.本研究采用游離酵母最優發酵條件,將等量游離酵母菌固定化后,進行重復批次發酵,分析固定化系統重復發酵性能.

由表1可知,第1批次發酵,固定化酵母在48h時,乙醇得率已達到最高,作為發酵基質的葡萄糖也被消耗殆盡,而前期研究中[18-19],游離酵母在同等發酵條件下,達到最高乙醇得率需 72h.分析其原因主要是由于:與游離酵母細胞發酵的微環境相比,固定化粒子與包裹在表面的發酵液形成的微環境中,細胞密度較高,固定化粒子內部消耗葡萄糖較快,發酵液中基質濃度與固定化粒子內部基質濃度差增大,有利于葡萄糖的傳質[20],并且載體可保護酵母細胞免受水力剪切的影響[16],從而提升發酵速率,縮短發酵周期.

固定化酵母第1批次發酵中,雖在48h時乙醇得率達到最高,但考慮到固定化酵母重復批次發酵中發酵性能的退化,發酵速率逐漸下降,后續批次發酵周期仍為72h.此外,由表1可知,第1批次時,48h時葡萄糖已消耗殆盡;第2批次時,發酵72h后,葡萄糖仍有剩余;第3批次時,發酵72h后,葡萄糖仍有 33.6g/L,乙醇得率僅為 35%.固定化發酵系統發酵性能逐漸下降,主要是由于酒精發酵過程中,乙醇濃度逐漸增大,產生反饋抑制,而且濃度越大,抑制作用越強[21].乙醇不僅可以抑制糖代謝和轉運途徑,還可抑制細胞膜上ATP酶活,最終削弱細胞膜對酵母細胞的保護作用.另外,乙醇還可引起細胞內線粒體的氧化損傷[22-23].隨著循環利用次數的增加,乙醇對酵母細胞抑制作用時間就越長,從而對酵母細胞造成不可逆的破壞,使部分菌體喪失了發酵能力,發酵性能逐漸下降[16].為減小產物對酵母的抑制作用,減緩固定化粒子循環利用過程中發酵性能的下降,后續通過增殖活化和批次短周期發酵對固定化粒子的發酵性能進行調控.

表1 固定化酵母重復發酵乙醇濃度和乙醇得率變化Table 1 Ethanol concentration and theoretical yield of immobilized cells repeated batch fermentation

2.2 固定化酵母重復發酵性能調控

2.2.1 增殖活化 針對固定化粒子循環發酵性能退化問題,于第1批次乙醇發酵前,對固定化粒子進行增殖活化處理,使固定化酵母細胞生物活性處在最佳狀態[17],而后進行后續發酵操作.增殖活化時添加 CaCl2,可緩解蛋白胨中多元酸對海藻酸鹽基質中配位 Ca2+的競爭鰲合而導致的海藻酸鈣凝膠的解聚[24],進而避免增殖過程中固定化粒子機械強度的降低、海藻酸鈣包埋能力的下降.巫小丹等[25]在發酵基質中添加 CaCl2,發現CaCl2有助于維持固定化小球的強度和形態,經多次發酵后小球形態基本一致.

由表2可知,第1批次發酵中,增殖活化固定化酵母發酵24h時,發酵已經結束,發酵液中葡萄糖被完全利用,與表1中固定化酵母第1批次發酵相比,發酵時間縮短,最大乙醇得率提高了4%.并且,增殖活化固定化酵母重復發酵,第1批次時,最大乙醇得率為86%,第3批次時,最大乙醇得率為49%.而固定化酵母重復發酵(表1),第1批次時,最大乙醇得率為82%,第3批次時,最大乙醇得率為35%.增殖活化固定化酵母乙醇得率下降幅度較小,發酵性能退化較慢,將固定化粒子和增殖活化固定化粒子破囊后,菌體包埋量分別為 8.95×108,1.06×109個/mL凝膠,增殖活化固定化粒子的菌體包埋量高于固定化粒子的菌體包埋量.因此,固定化粒子通過增殖,發酵性能得到改善,可能是由于菌體密度的增加.此外,牛春鈴等[26]還發現高密度菌體能有效提高了菌體的酒精耐受性能,Lee等[5]也發現固定化粒子的多孔結構和固定化粒子中高密度的酵母細胞是加速葡萄糖轉化為乙醇的主要因素.

表2 增殖活化固定化酵母重復發酵乙醇濃度和產率變化Table 2 The change of Ethanol concentration and yield changes in repeated batch fermentation using activated immobilized cells

2.2.2 批次短周期發酵 由表1、表2第1批次發酵過程中均可看出,發酵后期乙醇濃度下降,這主要是由于葡萄糖被耗盡,菌體進入內源呼吸期,缺乏維持生長的碳源,酵母菌將乙醇作為新的碳源進行新陳代謝[18,27].同時,由表2觀察到,增殖活化固定化酵母第1批次發酵在24h時,乙醇濃度達到最大.為避免固定化酵母進入內源呼吸期,長時間處于高濃度乙醇的發酵液中,減輕乙醇對酵母細胞的損傷,本研究采用批次短周期發酵.發酵結束后,與增殖活化固定化酵母重復發酵實驗進行對比(圖1).

由圖1可知,批次短周期發酵第2批次發酵結束后,乙醇得率大幅下降,固定化細胞乙醇發酵能力逐漸衰退, 但每批次的乙醇濃度和乙醇得率均高于增殖活化固定化酵母重復發酵每批次的乙醇濃度和乙醇得率.此外,批次短周期發酵平均乙醇生產強度為 1.20g/(L·h),增殖活化固定化酵母重復批次發酵的平均乙醇生產強度為0.33g/(L·h),Behera等[16]采用海藻酸鈉固定化酵母菌,連續4批次循環發酵,平均乙醇生產強度為0.268g/(L·h).由此可見,批次短周期發酵可減緩固定化酵母重復發酵性能的退化,從而乙醇生產強度大幅提高.

圖1 增殖活化固定化酵母重復發酵與批次短周期發酵乙醇濃度和得率變化Fig.1 The changes of ethanol concentration and yield compared activated immobilized cells with short period of each batch fermentation

圖2 第2批次后、第3批次前再次增殖批次發酵乙醇生產強度與乙醇得率變化Fig.2 The change of volumetric ethanol productivity and ethanol yield changes after reproducing activation immobilized cells between cycle 2 and cycle 3

固定化細胞的生產成本,取決于重復利用中被固定細胞發酵能力持續時間的長短,傳質效率的高低,以及目標產品純度是否降低下游分離提純操作成本[28].然而,固定化粒子經發酵前增殖活化和批次短周期發酵,雖能夠提高乙醇生產強度,但第2批次發酵結束后,乙醇得率變開始大幅下降.為降低固定化成本,在第2批次結束后再次對固定化粒子增殖活化恢復固定化酵母乙醇發酵能力,使固定化酵母細胞保持較長時間的發酵能力,增加循環發酵次數.由圖 2可知,第 2批次后、第 3批次前再次增殖,固定化酵母發酵性能在第3批次得到恢復,第4批次開始乙醇得率逐漸下降,但連續5批次的循環發酵保持較高的平均乙醇生產強度1.22g/(L·h),有利于乙醇的高效、高負荷生產.由此可見,固定化粒子重復批次發酵性能下降后,增殖活化能夠恢復其發酵能力,但恢復后經連續 2個批次循環發酵,乙醇得率開始逐漸下降.綜上,固定化粒子發酵性能通過增殖活化和批次短周期發酵的調控得到明顯改善.調控前,連續3批次發酵,平均乙醇生產強度為0.33g/(L·h) (表1);調控后,連續5批次發酵,平均乙醇生產強度提高至1.22g/(L·h).

2.3 重復批次發酵中固定化粒子形貌變化

由圖1可知,第2批次后,乙醇得率下降比較明顯.因此,取發酵前的固定化粒子和第2批次發酵結束的固定化粒子,通過SEM觀察固定化粒子表面和內部結構的變化及細胞分布情況,對重復批次發酵中固定化酵母發酵性能變化進行分析.

圖3 重復批次發酵中固定化粒子形貌變化Fig.3 Electronic photomicroscope morphology of immobilized particles in repeated batch fermentation

發酵前(圖3a、圖3b),固定化粒子表面結構致密,固定化載體表層包有密度較高的酵母細胞,顆粒內部也布滿酵母細胞;第 2批次結束后(圖3c、圖3d),固定化粒子表面疏松多孔,是由于發酵過程中菌體的繁殖以及CO2產生的壓力,導致海藻酸鈣凝膠粒子的表面結構發生改變[28],包埋力下降,顆粒表面的細胞脫落留下的,但顆粒內部的細胞密度卻略有增加.由此可知,酵母細胞的泄漏只是載體表面少量細胞的脫落,顆粒內部的細胞并沒有泄露,反而略有增加.并且,據 Behera等[16]研究,發酵液中液系細胞數小于固定化酵母數的5%,起發酵作用的仍是固定化酵母.因此,引起發酵性能退化的主要原因并不是泄漏,而是發酵過程中乙醇的反饋抑制導致部分菌體喪失了發酵能力.

3 結論

3.1 固定化粒子經增殖活化和批次短周期發酵調控后,發酵性能得到明顯改善.調控前,連續3批次發酵,平均乙醇生產強度為0.33g/(L·h);調控后,連續 5批次發酵,平均乙醇生產強度提高至1.22g/(L·h).

3.2 批次短周期發酵,能夠減緩固定化粒子隨循環發酵次數增加導致批次發酵乙醇得率下降的問題.本研究中,固定化發酵系統批次發酵周期由72h縮短為24h后,連續發酵3批次,批次乙醇得率保持在60%以上.

3.3 固定化粒子發酵性能下降后,增殖活化能夠恢復其發酵能力.固定化發酵系統循環發酵 5個批次,第2批次后乙醇得率降至78%,經增殖活化第3批次恢復至88%.

3.4 隨著固定化酵母重復利用次數的增加,固定化粒子表面細胞逐漸脫落,但泄漏并不是引起固定化酵母性能退化的主要原因,而是發酵過程中乙醇的反饋抑制導致部分菌體喪失了發酵能力.

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致謝：本實驗樣品中乙醇濃度和基質濃度檢測,由上海交通大學環境科學與工程學院中心實驗室協助檢測,在此表示感謝.

國務院社會信用體系建設規劃綱要要求建立環境管理和監測信息公開制度

國務院日前發布《社會信用體系建設規劃綱要(2014～2020年)》(以下簡稱《綱要》),部署加快建設社會信用體系、構筑誠實守信的經濟社會環境.

在環境保護和能源節約領域信用建設方面,《綱要》指出,要推進國家環境監測、信息與統計能力建設,加強環保信用數據的采集和整理,實現環境保護工作業務協同和信息共享,完善環境信息公開目錄.建立環境管理、監測信息公開制度.完善環評文件責任追究機制,建立環評機構及其從業人員、評估專家誠信檔案數據庫,強化對環評機構及其從業人員、評估專家的信用考核分類監管.建立企業對所排放污染物開展自行監測并公布污染物排放情況以及突發環境事件發生和處理情況制度.建立企業環境行為信用評價制度,定期發布評價結果,并組織開展動態分類管理,根據企業的信用等級予以相應的鼓勵、警示或懲戒.完善企業環境行為信用信息共享機制,加強與銀行、證券、保險、商務等部門的聯動.加強國家能源利用數據統計、分析與信息上報能力建設.加強重點用能單位節能目標責任考核,定期公布考核結果,研究建立重點用能單位信用評價機制.強化對能源審計、節能評估和審查機構及其從業人員的信用評級和監管.研究開展節能服務公司信用評價工作,并逐步向全社會定期發布信用評級結果.加強對環資項目評審專家從業情況的信用考核管理.

摘自中國環境報

2014-07-01

Performance of repeated fermentation using recycled immobilized yeast.

ZHANG Xiao-ling1, LI Wen1, WANG

Jing-nan1, RUAN Xin-yi2, KONG Hai-nan2, LIN Yan2*(1.College of Environmental Science and Engineering, Chang’an University, Xi’an 710064, China；2.School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China). China Environmental Science, 2014,34(7)：1797～1803

Saccharomyces cerevisiae was embedded by 2.5% (w/v) sodium alginate and 2% (w/v) calcium chloride at the yeast concentration of 2% (w/v, dry cells). The immobilized yeast was employed to produce ethanol continuously in repeated batch fermentation system. In order to slow down the performance degradation of immobilized yeast cells, regulation of their fermentation capability was conducted through Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) medium activated. Additionally, the structure of immobilized particles and the distribution of yeast cells were characterized by Scanning Electron Microscope (SEM). The immobilized beads fermentation performance was significant improved after regulated. The experiment was carried out with the condition of pH 4.0, 35℃ when the glucose concentration was 80g/L. the experiment results showed: before regulated, the mean value of ethanol volumetric productivity was 0.33g/(L·h) in three sequential fermentation cycles; after regulated, the fermentation time of each batch was shorted from 72h to 24h, the mean value of ethanol volumetric productivity was 1.22g/(L·h) in five sequential fermentation cycles.

biofuel；fermentation；sodium alginate；Saccharomyces cerevisiae；immobilization

X705

A

1000-6923(2014)07-1797-07

張小玲(1976-),女,陜西西安人,副教授,博士,主要從事污水處理及回用研究.發表論文18篇.

2013-09-12

上海市自然科學基金(11ZR1417200);中央高校基本業務費項目(CHD2012JC032);陜西省教育廳科研計劃項目(12JS053).

* 責任者, 副教授, linyansjtu@126.com