北京官廳水庫水體甲狀腺激素干擾效應檢測及特征

李 劍,任姝娟,李沫蕊,王亞飛 (北京師范大學水科學研究院,地下水污染控制與修復教育部工程研究中心,北京 100875)

北京官廳水庫水體甲狀腺激素干擾效應檢測及特征

李 劍*,任姝娟,李沫蕊,王亞飛 (北京師范大學水科學研究院,地下水污染控制與修復教育部工程研究中心,北京 100875)

應用重組人甲狀腺激素受體(hTR)基因酵母快速測試方法,檢測北京官廳水庫水體類/抗甲狀腺激素干擾效應,并分析其地理分布、季節(jié)分布特征以及水體甲狀腺激素干擾化合物(TDCs)組成特征.結果表明:官廳水庫水體檢出了顯著的抗甲狀腺激素干擾效應,與其它研究區(qū)域相比,效應處于較低到中等水平;入庫河流對庫區(qū)水質(zhì)產(chǎn)生顯著影響,且入庫河流水質(zhì)受季節(jié)影響顯著,因此,庫區(qū)水體不同季節(jié)甲狀腺激素干擾水平存在差異;C18固相萃取柱對抗甲狀腺激素干擾效應的去除率在61.9%～92.3%,表明官廳水庫水體中的甲狀腺激素抑制活性物質(zhì)多集中在有機組分,加入30mg/L的EDTA后TR抑制活性顯著降低,表明官廳水庫水體中TDCs除有機化合物外可能還包含重金屬類無機化合物.

重組基因酵母；甲狀腺激素干擾化合物；官廳水庫；甲狀腺激素干擾效應

一些環(huán)境化合物具有潛在的甲狀腺激素干擾活性,如酚類化合物、農(nóng)藥、持久性有機污染物、溴代阻燃劑等[1].這些具有甲狀腺激素干擾活性的化合物通常被稱為甲狀腺激素干擾物(TDCs),TDCs已成為繼環(huán)境雌激素之后最重要的一類內(nèi)分泌干擾物[2].研究證實,TDCs能夠伴隨人類生產(chǎn)、生活活動進入環(huán)境水體,對人類健康和生態(tài)安全造成重大威脅.

環(huán)境水樣TDCs檢測方法通常包括生物測試方法和化學分析方法兩大類[3].生物測試的結果不僅能夠反映環(huán)境樣品中TDCs的濃度水平,而且能夠表征 TDCs的效應特征.其中,重組甲狀腺激素受體(TR)基因酵母法是檢測環(huán)境水樣TDCs的一種重要的生物測試方法,具有穩(wěn)定、經(jīng)濟、高效的特點,且通過該方法能夠檢測出水體類/抗甲狀腺激素干擾效應[4].環(huán)境水樣通常都要經(jīng)過復雜的前處理后才能進行分析測定.環(huán)境水樣 TDCs檢測時通常采用的前處理方法包括液液萃取、固相萃取、微波萃取等[5].環(huán)境水樣前處理通常需要消耗大量有機溶劑,危害環(huán)境,且操作時間較長;而且前處理方法在富集、濃縮的過程中也可能造成環(huán)境中未知 TDCs的損失,因此測試結果不能反映環(huán)境水樣甲狀腺激素干擾的真實情況.因此,本實驗室開發(fā)出一套無需復雜樣品前處理的環(huán)境水樣甲狀腺激素干擾效應重組基因酵母體外快速測試方法,已證實能夠應用于環(huán)境水樣類/抗甲狀腺激素干擾效應的檢測[6].

環(huán)境水樣中的 TDCs按照性質(zhì)的不同,可分為有機類和無機類.有機 TDCs的研究是目前的熱點,水環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)的有機TDCs種類繁多.對于無機TDCs的研究較少,Boas等僅報道高氯酸鹽具有甲狀腺激素干擾活性[1].早期的研究證實,重金屬離子Zn2+、Cu2+、Cd2+也具有抑制甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸T3和TR結合的活性[7];特別是 Zn2+,生物學研究已經(jīng)證實該元素對于調(diào)節(jié) TR介導的基因轉錄具有至關重要的作用[8].但是,目前對于環(huán)境水樣的研究多集中于有機組分甲狀腺激素干擾效應的檢測[9-10],鮮見水體無機組分干擾效應的報道.

因此,本研究選擇北京官廳水庫水體作為研究對象,分枯/豐水期分別采集水樣,采用重組基因酵母快速測試方法,考察北京官廳水庫水體甲狀腺激素干擾效應水平及其季節(jié)、地理分布特征.水樣經(jīng)C18柱固相萃取、EDTA處理后分別考察類/抗甲狀腺激素干擾效應變化,分析有機組分、無機組分對水體甲狀腺激素干擾效應的貢獻,初步探討水體TDCs的組成特征.

1 實驗部分

1.1 樣品采集

2012年5月和9月分別對北京官廳水庫水樣進行采集,采樣點如圖1所示.每個樣點采集水樣 2.5L,以清潔玻璃瓶盛裝;采集后 24h內(nèi)采用0.7μm玻璃纖維濾膜(Millipore,美國)過濾去除懸浮顆粒物,收集過濾水樣0.5L用于改進后的重組基因酵母方法快速測試.2L水樣經(jīng)C18柱(500mg, Waters,美國)固相萃取后收集柱后樣品 1L,其中0.5L用于快速生物測試,0.5L添加30mg/LEDTA后用于快速生物測試.

圖1 官廳水庫采樣點示意Fig.1 Sampling sites in the Guanting Reservoir

1.2 重組基因酵母體外快速測試

重組TR基因酵母由中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學國家重點實驗室提供.改進后的重組基因酵母快速測試方法參考文獻[6]進行,可簡單描述為:選擇對數(shù)生長期的酵母細胞,調(diào)節(jié)細胞密度使得 600nm處的吸光度 OD600nm值為0.75.5mL酵母細胞 1000g離心 5min(Sigma Laborzentrifugen 2K15,德國),棄去上清,加入4.5mL待測水樣及0.5mL 10×SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基;檢測水樣抗甲狀腺激素干擾效應時添加12.5μL 10-4mol/L T3(Sigma,美國).30℃振蕩培養(yǎng)(130r/min,HZQ-Q,中國)2h后,200μL溶液轉移到96孔板中,測定 600nm處的吸光度值(TECAN GENios A-5002,澳大利亞),每個樣品設4個平行.每孔吸取 100μL溶液加入新的 96孔板中,加入100μL 反應緩沖液(Tropix, Bedford, MA, USA)30

℃,800r/min,反應 1h,酶標儀測定發(fā)光值(TECAN GENios A-5002,Austria).

1.3 數(shù)據(jù)表征

β-半乳糖苷酶活性值的計算參考文獻[9].水樣類/抗甲狀腺激素干擾效應分別采用相對百分誘導活性P和相對百分抑制活性I表征,計算公式如下:

式中:u為環(huán)境水樣檢測的 β-半乳糖苷酶活性值;umax為T3在最大誘導效應濃度(2.5×10-7mol/L)誘導的β-半乳糖苷酶活性值.根據(jù)I值和抗甲狀腺激素標準化合物鹽酸胺碘酮(AH)的劑量-效應關系,參考文獻報道方法計算水樣AH當量[6,9].

1.4 質(zhì)量控制和質(zhì)量保證

為保證整個樣品前處理過程的可靠性,在樣品前處理過程中添加空白樣品(Mili-Q超純水),并同步進行生物毒性測試,對整個試驗流程進行監(jiān)控,保證生物測試實驗的可靠性[6].樣品平行測定3次,在實驗過程中嚴格添加陽/陰性對照并保證標準曲線的日校正.具體步驟如下:

檢測環(huán)境水樣時,每組樣品均添加陽性對照和陰性對照.陰性對照均采用 Mili-Q超純水;類甲狀腺激素干擾效應檢測時陽性對照選擇濃度為2.5×10-7mol/L T3溶液(溶解到Mili-Q超純水中);抗甲狀腺激素干擾效應檢測時陽性對照選擇2.5×10-7mol/L T3+10-7mol/L AH溶液(溶解到Mili-Q超純水中).

標準曲線進行日校正.基于陽性對照誘導/抑制酵母細胞酶活性的劑量-效應關系曲線,選取曲線線性部分 2～4個陽性對照濃度對標準曲線進行日校正.

為了去除環(huán)境樣品急性毒性(主要考慮對酵母的細胞毒性)對誘導/抑制酶活性的影響,添加酵母細胞急性毒性試驗.測定600nm處的吸光度,表征酵母細胞密度,與空白對照相判斷是否存在顯著差異,具有急性毒性的樣品不計算其誘導/抑制酶活性[11].

添加樣品回收率試驗.對于類甲狀腺激素干擾效應檢測,環(huán)境水樣中添加 2.5×10-7mol/L T3,回收率的計算公式為(加標樣品 T3當量-未加標樣品 T3當量)/2.5×10-7mol/L.對于抗甲狀腺激素干擾效應檢測,環(huán)境水樣中添加2.5×10-7mol/L T3及 10-7mol/L AH,回收率的計算公式為:(加標樣品AH當量-未加標樣品AH當量)/10-7mol/L.回收率測試結果大于 125%或小于 65%時,數(shù)據(jù)不可用[11].

2 結果與討論

2.1 官廳水庫水樣類/抗甲狀腺激素干擾效應采用快速測試方法對2012年5月和9月采集的官廳水庫水樣類/抗甲狀腺激素干擾效應進行檢測,所有測試樣品均未檢出顯著的酵母細胞急性毒性,實驗空白控制較好,樣品回收率為65.0%～119.9%,平均回收率為90.1%.測試結果如圖2所示,5月和9月水樣均未檢出顯著的類甲狀腺激素干擾效應,誘導酶活性值與空白對照相比未有顯著差異(P<0.05),表明官廳水庫水體中未有類甲狀腺激素干擾物或類甲狀腺激素干擾物的量低于本方法檢測限.測試結果與文獻報道類似,Li 等[12]對北京飲用水源地及飲用水不同處理工藝出水樣品檢測時也未發(fā)現(xiàn)明顯的TR誘導活性;Li 等[9]也報道廣州污水處理廠不同工藝出水不具有類甲狀腺激素干擾效應.

圖2 官廳水庫水樣類甲狀腺激素干擾效應Fig.2 Agonistic thyroid receptor activities of water from Guanting Reservoir

采用快速測試方法對官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應進行檢測,測試結果如圖3所示.除空白對照外,在官廳水庫8個采樣點,5月及9月樣品中均檢測出抗甲狀腺激素干擾效應,效應水平采用AH當量進行表征[9].2012年5月官廳水庫水樣 AH 當量濃度水平在(21.2±1.6)～(313.9±28.8)μg/L;9月官廳水庫水樣 AH當量濃度范圍在(21.0±1.0)～(2147.2±48.1)μg/L.將官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應水平與文獻報道值比較發(fā)現(xiàn),官廳庫區(qū)水體中抗甲狀腺激素干擾物濃度處于較低到中等污染水平(表1).

圖3 官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應Fig.3 Antagonistic thyroid receptor activities of water from Guanting Reservoir

2.2 官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應分布特征

2012年5月官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應AH當量濃度較高值出現(xiàn)在采樣點GR1、GR2和 GR5,當量濃度分別為:(313.9±28.8)、(113.0±4.1)和(188.0±19.6)μg/L;庫區(qū)內(nèi)其他采樣點 AH當量濃度值在(21.2±1.6)～(47.2±4.7)μg/L,遠低于上述3個采樣點.其中GR1采自永定河8號橋,反映入庫前永定河的水質(zhì)狀況;GR5采自永定河入庫口,GR2采自媯水河入庫口.永定河和媯水河是官廳水庫的兩條主要入庫河流,永定河 8號橋、永定河入庫口、媯水河入庫口水樣抗甲狀腺激素干擾效應遠高于官廳庫區(qū)其他幾個采樣點的效應值,表明庫區(qū)抗甲狀腺激素干擾物可能來自于永定河、媯水河的輸入.康躍惠等[13]研究了北京官廳水庫-永定河水系水體中持久性有機氯農(nóng)藥污染,也得出了類似的結論,認為官廳庫區(qū)水體中有機氯農(nóng)藥來自永定河、媯水河的輸入.

2012年9月官廳水庫水樣AH當量濃度較高值出現(xiàn)在采樣點GR1、GR5和GR6,當量濃度分別為:(2147.2±48.1)、(564.3±43.7)和(198.2± 14.8)μg/L.GR6采自永庫區(qū),靠近永定河入庫口.與 5月采集的樣品比較發(fā)現(xiàn),9月來自永定河輸入的抗甲狀腺激素干擾物的濃度明顯增加,永定河8號橋檢測到的AH當量濃度值是5月的6.8倍,且該類物質(zhì)輸入濃度的增加,不僅影響到永定河入庫口的水質(zhì),對于下游永庫區(qū)的水質(zhì)也產(chǎn)生了顯著的影響.9月由于媯水河出現(xiàn)斷流,媯水河入庫口水質(zhì)恢復,與庫區(qū)其他樣點相比抗甲狀腺激素干擾效應無顯著性差異.整個媯庫區(qū)的 AH當量濃度值與5月相比略有降低.由此可見,由于入庫河流水量、水質(zhì)受季節(jié)影響顯著,官廳水庫庫區(qū)水體抗甲狀腺激素干擾效應也呈現(xiàn)一定的季節(jié)變化規(guī)律.

表1 水樣抗甲狀腺激素干擾效應當量濃度比較Table 1 The antagonistic thyroid receptor activities of water samples collected in different area

綜合5月和9月采集樣品的測試結果表明,永定河是官廳水庫抗甲狀腺激素干擾物的重要輸入源,對官廳水庫水體水質(zhì)影響較大,應該引起重視.調(diào)查發(fā)現(xiàn),官廳水庫永定河上游的張家口宣化農(nóng)藥廠、懷來縣城的長城化工廠、洋河工業(yè)區(qū)的廢水排放以及生活污染排放可能是永定河污染的重要來源.

2.3 官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾物組成特征

本文借鑒USEPA建立的廢水TIE的方法初步探索官廳水庫水體TDCs的組成特征.TIE方法進行毒性鑒定的范圍涵蓋了氨氮、重金屬離子等無機物和各類有機物[16].本文參考該鑒定方法,其中氨氮類化合物根據(jù)之前的文獻報道及本實驗室的測試數(shù)據(jù)均證實該類化合物不具有TR的干擾活性(數(shù)據(jù)未列出),因此,重點考察水體中的重金屬類無機化合物和有機化合物對毒性的貢獻.

圖4 固相萃取(SPE)、添加EDTA對官廳水庫水樣抗甲狀腺激素干擾效應的影響Fig.4 Antagonistic thyroid receptor (TR) activities of the original water, residual water after the solid-phase extraction (SPE) and the treatment water after addition the EDTA

選擇2012年5月采集水樣,采用固相萃取方法(SPE),選用C18固相萃取柱對水體中的非極性有機組分進行富集,考察水樣萃取前后甲狀腺激素干擾效應的改變.測試結果表明萃取后的水樣仍未檢出顯著的類甲狀腺激素干擾效應(數(shù)據(jù)未列出).但是,萃取后水樣的抗甲狀腺激素干擾效應顯著降低(如圖 4);C18固相萃取柱對水樣抗甲狀腺激素干擾效應的去除率在 61.9%～92.3%,表明官廳水庫水體中的抗甲狀腺激素干擾化合物多為有機化合物,集中在有機組分中.Boas等[1]報道證實目前已篩選出大量具有抗甲狀腺激素干擾效應的有機化合物,比較典型的有多氯聯(lián)苯、溴代阻燃劑、鄰苯二甲酸酯等.Li等[10]及Shi等[14]對我國飲用水源水甲狀腺激素干擾效應調(diào)查發(fā)現(xiàn),鄰苯二甲酸酯是水體主要的抗甲狀腺激素干擾物.

樣點GR1、GR2和GR5經(jīng)萃取后的抑制效率與空白對照之間存在顯著性差異(P<0.05),表明C18固相萃取柱不能完全去除水體中的抗甲狀腺激素干擾物;官廳水庫水樣中除有機化合物外可能存在其他的抗甲狀腺激素干擾物.因此,向測試體系中加入30mg/L的EDTA(實驗證實該濃度對測試體系酶活性無影響,數(shù)據(jù)未列出),去除水樣中的重金屬離子,觀察水樣干擾效應的變化.測試結果如圖4,加入EDTA后水樣GR1、GR2和GR5抗甲狀腺激素干擾效應明顯降低,與空白對照相比無顯著差異,由此可初步推斷,官廳水庫水樣中抗甲狀腺激素干擾物除有機化合物外可能包含重金屬類無機化合物.Surks等[7]報道證實重金屬離子Zn2+、Cu2+、Cd2+能夠抑制甲狀腺激素T3和TR結合,特別是Zn2+在1μmol/L時即表現(xiàn)出顯著的抑制活性,添加重金屬螯合劑EDTA后能夠終止重金屬離子的抑制活性,促進甲狀腺激素誘導的基因轉錄.

3 結論

3.1 官廳水庫水體未檢出類甲狀腺激素干擾效應,但是具有抗甲狀腺激素干擾效應,與文獻報道相比,干擾效應處于較低到中等水平.

3.2 入庫河流對官廳水庫庫區(qū)水體抗甲狀腺激素干擾效應影響顯著,且入庫河流水質(zhì)、水量受季節(jié)影響,因此,庫區(qū)水體不同季節(jié)甲狀腺激素干擾水平也存在差異;庫區(qū)水體甲狀腺激素干擾效應水平雖然相對較低,但是存在新的污染輸入,如果恢復為北京的飲用水源地,則應該引起重視.

3.3 官廳水庫水體中具有抗甲狀腺激素干擾效應的化合物除了有機化合物外,一些無機組分如重金屬離子等,也可能產(chǎn)生甲狀腺激素的干擾作用;由此可見,僅僅研究環(huán)境樣品有機組分的甲狀腺激素干擾效應,不能反應環(huán)境樣品對甲狀腺系統(tǒng)干擾的真實水平.

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聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署為環(huán)境保護部部長周生賢頒發(fā)“環(huán)境政策與領導貢獻獎”

首屆聯(lián)合國環(huán)境大會高級別會議2014年6月26日在肯尼亞內(nèi)羅畢開幕.會議期間,聯(lián)合國授權聯(lián)合國副秘書長兼環(huán)境規(guī)劃署(以下簡稱“環(huán)境署”)執(zhí)行主任施泰納向周生賢頒發(fā)“環(huán)境政策與領導貢獻獎”.

施泰納高度贊賞中國政府在防治污染、發(fā)展經(jīng)濟和保護生態(tài)環(huán)境方面所做的努力.他表示,作為世界上最大的發(fā)展中國家,中國積極推進綠色經(jīng)濟和生態(tài)文明,踐行綠色發(fā)展、低碳發(fā)展和循環(huán)發(fā)展,在治理環(huán)境污染,特別是大氣、水、土壤污染防治,以及防止環(huán)境退化方面做出了巨大努力.中國還積極參與和推動國際環(huán)境治理及南南合作,中國在這些方面所取得的成就為世界所矚目.為表彰周生賢部長在推動中國環(huán)境保護事業(yè)和推進全球可持續(xù)發(fā)展進程中所發(fā)揮的杰出領導作用,聯(lián)合國授權環(huán)境署向周生賢部長頒發(fā)此獎項.

周生賢表示,這一獎項不僅是對其個人和環(huán)境保護部的莫大鼓勵,也是對中國政府為保護環(huán)境、發(fā)展綠色經(jīng)濟、推動全球可持續(xù)發(fā)展所做工作的充分肯定,榮譽屬于國家和人民.中國政府歷來高度重視環(huán)境保護,把環(huán)境保護確立為基本國策.近年來,更是把環(huán)境保護擺上更加突出的戰(zhàn)略位置,站在推進國家生態(tài)環(huán)境治理體系和治理能力現(xiàn)代化的高度,著力構建推進生態(tài)文明建設和環(huán)境保護的四梁八柱,各項工作取得積極進展.但是,中國在發(fā)展中不平衡、不協(xié)調(diào)、不可持續(xù)問題依然突出,中國的環(huán)境保護工作仍然任重而道遠.中國愿繼續(xù)加強與環(huán)境署的合作,與世界各國一道,共享發(fā)展機遇,共迎環(huán)境挑戰(zhàn),共同建設人與自然和諧發(fā)展的地球家園

摘自《中國環(huán)境報》

2014-06-27

Thyroid disrupting effects characterization of water from Guanting Reservoir, Beijing, China.

LI Jian*, REN

Shu-juan, LI Mo-rui, WANG Ya-fei (Engineering Research Center of Groundwater Pollution Control and Remediation, Ministry of Education, College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2014,34(7)：1884～1889

A rapid recombinant human thyroid hormone receptor (hTR) gene yeast bioassay was used to evaluate the thyroid disrupting effects in the water from the Guanting Reservoir (GR), Beijing, China. Furthermore, the geographic and seasonal distribution, and thyroid disrupting chemicals (TDCs) composition characteristics of water were analysed. The results revealed that water samples had TR antagonistic activities. The Guanting Reservoir water displayed a low to moderate effect on thyroid hormone signalling, which was impacted by the input river. The effects of the input river were significantly affected by season, so the effects of reservoir water were temporally variable. A solid phase extraction by C18cartridges was used to separate the organic extracts, which eliminated 61.9%～92.3% antagonistic activities, suggesting the organic extracts may play a major role in the TR disruption effect of the water. After addition of EDTA (30mg/L) to the residual water samples, the antagonistic activities decreased significantly, showing the metals might contribute to the TR antagonistic activity.

recombinant gene yeast；thyroid disrupting chemicals；Guanting Reservoir；thyroid disrupting effects

X703.5

A

1000-6923(2014)07-1884-06

李 劍(1980-),女,重慶人,副教授,博士,主要從事水生態(tài)毒理學研究.發(fā)表論文40余篇.

2013-10-10

國家自然科學基金資助項目(41001351);中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助項目(2012LYB35);高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(20100003120024)

* 責任作者, 副教授, lijian@bnu.edu.cn