環維黃楊星D對大鼠心力衰竭的治療作用

黃丹丹,邵靚婧,許立

(南京軍區南京總醫院 1.藥品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中醫藥大學藥學院,南京 210029)

環維黃楊星D對大鼠心力衰竭的治療作用

黃丹丹1,邵靚婧2,許立3

(南京軍區南京總醫院 1.藥品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中醫藥大學藥學院,南京 210029)

目的 通過觀察環維黃楊星D(CVB-D)對心力衰竭(心衰)大鼠心臟功能和心肌形態、結構的影響,探討CVB-D對心衰的治療作用。方法結扎SD大鼠冠脈左前降支復制大鼠心衰模型,隨機分為5組,另加假手術組。應用超聲心動儀檢測心功能指標:左室后壁舒張期厚度(LVPWd)、左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室舒張末期內徑(LVIDd)、射血分數(EF)、心率(HR)、心輸出量(CO)、左室短軸縮短率(LVSF)、每搏輸出量(SV);制作心肌組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織學改變,透射電鏡觀察心肌超微結構的變化。結果與模型對照組比較,CVB-D中、大劑量組EF、LVSF明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中劑量組可見SV增加(P＜0.05),CVB-D小、中、大劑量組顯示CO增加(P＜0.05),CVB-D大劑量組顯示LVIDs減少,LVPWs增加(P＜0.05)。光鏡下CVB-D各劑量組使受損心肌組織出現不同程度的變化:心肌纖維排列逐漸整齊,橫紋逐漸明顯,輪廓逐漸清晰。透射電鏡下心肌超微結構發生變化:CVB-D使受損心肌纖維斷裂減少,線粒體數量增多、腫脹變性減輕。結論CVB-D對心衰大鼠心臟收縮、泵血功能有明顯的改善作用,對心肌肌纖維、線粒體的損傷有緩解作用,推測CVB-D對心衰存在一定的治療作用。

環維黃楊星D;心力衰竭;心功能

環維黃楊星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)為黃楊生物堿中主要的有效單體。我國研究環維黃楊星D已有40年,取得了不少成果。臨床上廣泛用于治療心律失常、心絞痛、冠心病,尤其作為一種非苷類強心藥受到普遍關注[1-4]。CVB-D對心血管系統作用廣泛,對多種心血管疾病具有療效好、口服用藥安全、長期應用毒副作用低的特點,這些為進一步研究和開發CVB-D提供了良好的基礎。筆者在本實驗通過復制大鼠心力衰竭(心衰)模型,觀察CVB-D對心衰大鼠心功能和心肌形態的影響,從而探討CVB-D對心衰的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物 斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠:清潔級,雄性,250～280 g,南京醫科大學實驗動物中心提供。合格證號:SCXK(蘇)2013-0005,使用許可證號:SYXK(蘇)2012-0042。實驗大鼠正常給予飼料,飲水,室溫:20～25℃,相對濕度:60%～70%,保持通風。

1.2 試劑 CVB-D:類白色結晶,由南京小營藥廠提供,純度≥95%,批號:X091027。CVB-D難溶于水,溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS),加入微量冰醋酸(終濃度不超過0.1%)全部溶解后,調pH到7.2。溶媒對照組:PBS溶液,pH調到7.2;地高辛片(上海信誼藥廠有限公司生產,規格:0.25 mg,批號:120103)。

1.3 儀器 Vevo770型高分辨小動物超聲儀(加拿大Visualsonics公司),型號:ALC-V8型動物呼吸機(上海奧爾科特醫療儀器公司)。

1.4 造模與分組 結扎SD大鼠冠脈左前降支制造大鼠心衰模型:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉,取仰臥位,固定四肢、牙齒于操作臺上。鈍性分離肌肉至氣管,插入氣管插管后接小動物呼吸機[1,5-6]。2周后檢測超聲心動,以射血分數(ejection fraction,EF)＜50%為造模成功。造模成功后心衰大鼠隨機分為5組:模型對照組(12只),地高辛組(0.032 mg·kg-1)、CVB-D的小、中、大3個劑量(0.500,1.000,2.000 mg·kg-1)(各10只),另制備假手術組(8只),共計6組。連續灌胃60 d,qd,給藥體積:10 mL·kg-1。

1.5 觀察大鼠一般情況 存活率、飲食、活動情況等。

1.6 超聲心動指標 左室后壁舒張期厚度(left ventricular posterior wall at end-diastole,LVPWd)、左室后壁收縮期厚度(left ventricular posterior wall at endsystole,LVPWs)、左室收縮末期內徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左室舒張末期內徑(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、EF、心率(heart rate,HR)、心排血量(cardiac output,CO)、左室短軸縮短率(left ventricular shortening fraction,LVSF)、每搏排血量(stroke volume,SV)。

1.7 病變嚴重程度 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察病變嚴重程度,輕度“+”,中度“++”,重度“+++”。

1.8 透射電鏡觀察 心肌纖維、肌節、線粒體、質膜等的變化。

2 結果

2.1 一般狀況 心衰模型對照組大鼠于灌胃給藥的第3天、第15天、第40天、第50天各死亡1只。地高辛組于給藥的第10天死亡1只。CVB-D小劑量組于給藥的第7天、第20天各死亡1只。CVB-D中劑量組于給藥第10天和第28天各死亡1只。CVB-D大劑量組于給藥第18天死亡1只。心衰大鼠隨著造模時間的延長出現進食減少、活動量減少、腹水、足部水腫等。

2.2 心衰大鼠超聲心動結果 與假手術組比較,模型對照組心衰大鼠EF、LVSF、SV、CO、LVPWs顯著減少; LVIDd、LVIDs則顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)。與模型對照組比較,CVB-D中、大劑量組EF、LVSF明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中劑量組可見SV增加(P＜0.05);CVB-D小、中、大劑量組顯示CO增加(P＜0.05),CVB-D大劑量組顯示LVIDs減少, LVPWs增加(P＜0.05)。見表1。

2.3 HE染色 假手術組:心臟心肌細胞橫紋清晰,未見增生肥大、萎縮、斷裂,無細胞變性、壞死等病變,間質無水腫及炎性細胞浸潤,心外膜、心內膜無異常。模型對照組:心臟大部分心肌細胞重度變性壞死(+++),間質纖維結締組織重度增生(+++),伴輕度炎細胞浸潤(+);部分心臟局灶性心肌細胞變性壞死(+),間質纖維結締組織增生(+)。CVB-D小、中、大劑量給藥組出現不同程度地變化,心肌纖維逐漸變細、肌纖維排列逐漸整齊,“分枝”狀與“漩渦”狀漸漸消失,細胞核染色變淺,相對均勻,且形狀整齊。見圖1。

2.4 透射電鏡 假手術組肌纖維排列有序、緊密,肌節排列正常,Z線清晰,線粒體大小較一致,質膜清晰、完整,嵴清晰、致密。模型對照組肌纖維排列紊亂,絕大部分斷裂,肌節萎縮、斷裂、排列無序、肌絲溶解,線粒體數量減少,腫脹變性明顯,質膜部分破裂,嵴明顯減少、斷裂、變短、雜亂分布。CVB-D大劑量組肌纖維排列有所改善,肌纖維斷裂減少,線粒體數量增多,腫脹變性減輕。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。見圖2。

3 討論

對于心衰的研究,無論是從治療技術方面還是藥物方面,最基本的就是建立心衰模型。復制動物心衰模型的方法有許多種:冠狀動脈結扎法、冠狀動脈堵塞法、主動脈縮窄法、動靜脈瘺法、心臟瓣膜關閉不全法、藥物損害法等[7]。本實驗采用冠狀動脈結扎法,結扎左前降支,造成心肌急性梗死,隨著結扎時間的延長,心肌出現炎癥反應,梗死區域心室壁變薄,可觀察到左室腔擴大,心肌收縮力明顯減弱。這類模型模擬心肌

梗死演變到心衰的病理過程,這一病理過程中心肌細胞、亞細胞的改變及心肌線粒體的變化與人類心衰相似[8]。此造模方法,相對其他方法而言,技術要求高,模型死亡率比一般方法高,造模時間相對長,其優點在于模擬人類心衰,用于藥物研究更具有臨床意義[9]。

表1 6組大鼠超聲心動圖檢測指標比較Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

表1 6組大鼠超聲心動圖檢測指標比較Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) EF LVSF % SV/ μL HR/ (次·min-1)假手術組8…74.92±3.59*145.27±3.23*1229.42±47.09*2393.87±72.90模型對照組8…36.78±10.77 18.88±6.12 181.64±36.57 422.50±49.79地高辛組9 0.032 51.23±8.80*227.74±5.72*1249.73±47.09 431.12±22.79 CVB-D小劑量組8 0.500 46.49±9.39 24.67±5.69 227.51±39.54*2420.00±87.78中劑量組8 1.000 50.84±11.97*227.57±7.45*2229.11±37.28*2414.62±57.10大劑量組9 2.000 53.10±5.15*128.82±3.43*1mm假手術組96.95±23.63*22.01±0.15 3.17±0.23*27.56±0.77*14.14±0.57*1256.66±35.88 385.25±92.71組別CO/ (mL·min-1) LVPWd LVPWs LVIDd LVIDs模型對照組70.98±15.97 2.02±0.18 2.70±0.33 9.56±0.97 7.79±1.31地高辛組76.60±7.49*22.12±0.33 3.08±0.41*29.40±0.72 6.81±0.98 CVB-D小劑量組94.73±24.16*21.94±0.20 3.06±0.18 9.49±1.39 7.21±1.54中劑量組95.94±25.53*21.91±0.26 3.05±0.46 9.14±0.97 6.67±1.34大劑量組95.21±28.45*22.07±0.24 3.41±0.42*29.31±0.68 6.64±0.68*2

A.假手術組;B.模型對照組;C.地高辛組;D.CVB-D小劑量組;E.CVB-D中劑量組;F.CVB-D大劑量組圖1 6組大鼠心臟組織HE染色圖(×200)A.sham group;B.model group;C.digoxin group;D.low-dose CVB-D group;E.middle-dose CVB-D group;F.high-dose CVB-D groupFig.1 HE staining on cardiac tissue of six groups of rats(×200)

A.假手術組;B.模型對照組;C.地高辛組;D.CVB-D大劑量組圖2 4組大鼠心臟組織透射電鏡檢查結果(×25 000)A.sham operation group;B.model group;C.digoxin group;D.high-dose CVB-D groupFig.2 Detection results of cardiac tissue in four groups of rats by transm ission electron m icroscopy(×25 000)

采用超聲心動指標來診斷大鼠心衰模型是否成功,同時采用超聲心動相關指標及參數的改變來評價藥物對心衰大鼠的療效[10]。此方法是一個無創傷性的檢驗方法,避免了因為創傷而導致的誤差[11],而且又可以連續動態觀察模型動物的心功能狀態,因此超聲心動圖能很好地評價心衰動物模型的成功與否,科學實驗中值得推廣和使用。實驗發現:模型對照組大鼠的心功能較假手術組有顯著下降,模型對照組大鼠心臟射血分數EF＜47%,假手術組大鼠心臟射血分數EF＞70%,差異有統計學意義,表明造模成功。造模成功后給藥,CVB-D小、中、大(0.500,1.000和2.000 mg·kg-1)3個劑量組,給藥60 d后結果顯示CVB-D對心衰大鼠心臟收縮和泵血功能有明顯的改善作用,從而推測CVB-D對心衰存在一定的治療作用。

實驗中發現:CVB-D使受損的心肌組織發生了形態學改變,主要表現為肌纖維排列整齊,橫紋出現且輪廓清晰,心肌細胞變性壞死減輕。同時受損心肌超微結構發生變化:肌纖維斷裂減少,線粒體數量增多,腫脹變性減輕。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。線粒體對心肌細胞生理功能的維持具有重要作用,同時線粒體的氧化代謝與心肌收縮的能源和張力密切相關,其線粒體結構的完整性與心肌功能緊密相連。因此, CVB-D能夠改善受損心肌的形態和結構,對心衰的心臟起到一定的改善作用。

綜上所述,CVB-D對大鼠的心衰有一定治療作用,此作用與改善心功能,改善心肌形態和結構有關。

[1] 梁秉文,張正性,方泰惠.黃楊堿與心腦血管疾病[M].北京:化學工業出版社,2011:190.

[2] 梁濤,方泰惠,姚秀娟.環維黃楊星D藥理研究進展[J].解放軍藥學學報,2001,17(1):35-37.

[3] 周玖瑤.環維黃楊星D藥理研究概況[J].廣州中醫藥大學學報,2005,22(1):70-74.

[4] 譚峰,顧衛,吳海科.環維黃楊星D的臨床與實驗研究近況[J].中國中醫急癥,2005,1(7):683-684.

[5] 楊迪成,肖明第,盧成寶.心肌缺血-再灌注模型血流動力學的實驗研究[J].醫學研究生學報,2006,19(6): 524-525.

[6] 梁正.關于急性心肌缺血早期心肌標記物的研究[D].太原:山西醫科大學,2012.

[7] 劉新賓,李力.心力衰竭動物模型研究進展[J].分子生物醫學,2011,17(11):1601-1604.

[8] 王軍,白玲,李晶,等.心力衰竭大鼠心肌線粒體蛋白質組學研究[J].中國科學C輯:生命科學,2009,39(11): 1019-1027.

[9] 張得鈞,杜恒,劉明成,等.藏藥莪達夏對大鼠心肌缺血-再灌注NO和NOS的影響[J].中國現代應用藥學, 2013,30(10):1054-1058.

[10] 朱文暉,張曉紅,肖淵茗.超聲心動圖評價心力衰竭大鼠模型心功能改變[J].中南大學學報:醫學版,2009,34 (5):453-456.

[11] 張浩,侯邁,胡盛壽.小鼠心肌梗死模型的建立和無創超聲評價[J].中國微創外科雜志,2007,7(11):1111-1112.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.006

Therapeutic Effects of Cyclovirobuxine D on Rats with Heart Failure

HUANG Dan-dan1,SHAO Jing-jing2,XU Li3
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Hematology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing 210002,China;3.School of Pharmacy, Nanjing University ofChinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the therapeutic effect of cyclovirobuxine-D(CVB-D)on heart failure by observing the influences of CVB-D on cardiac function,myocardialmorphology and structure in ratswith heart failure.MethodsThe rat model of heart failure was established by ligating left anterior descending coronary artery,and then the ratswere randomly divided into 5 groups,plus the sham group.Echocardiography was used to assess cardiac function,including EF,LVSF,SV,HR,CO and so on.Myocardial tissue section was obtained.Change in the myocardial tissue was observed by HE staining.Myocardial ultrastructure was observed by using transmission electronmicroscope.ResultsAs compared with themodel group,EF and LVSF were significantly increased inmedium and high dose CVB-D groups(P＜0.05 orP＜0.01),SV was increased in low andmedium dose CVB-D groups(P＜0.05),CO was increased in low,medium and high dose CVB-D groups(P＜0.05),LVIDs was decreased and LVPWs was increased in high dose CVB-D group(P＜0.05).Under light microscope,changes of myocardial structureswere observed in different CVB-D dose groups:myocardial fiber gradually became tidy,stripes became clear,and contour became clear.The changes of myocardial ultra-structure were observed under transmission electron microscope:the myocardial fiber breakage was reduced and the number ofmitochondria was increased,swelling degeneration was alleviated.ConclusionCVB-D significantly improved cardiac contraction and blood pumping function of rats with heart failure,exerted mitigative effect on damage of cardiacmuscle fiber and mitochondria.It suggests that CVB-Dmay be effective in the treatment of heart failure.

Cyclovirobuxine D;Heart failure;Heart function

R285.5;R541

A

1004-0781(2014)12-1562-04

2013-12-25

2014-04-17

黃丹丹(1982-),女,江蘇南通人,藥師,碩士,研究方向:臨床藥學。電話:(0)13404166202,E-mail: huangdandan2002@sohu.com。

許立(1964-),男,江蘇南通人,教授,博士,研究方向:藥理學。電話:(0)13851572203,E-mail:xuli64@163. com。