大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞的作用*

劉漪淪,鄧峰美,劉衛華,羅永慧,趙寧寧,劉海榮,劉月明,王航宇

(1.成都醫學院第一附屬醫院燒傷整形外科,成都 610500;2.成都醫學院病理學與病理生理學教研室,成都 610500;3.成都醫學院第一附屬醫院科研實驗中心,成都 610500;4.石河子大學藥學院,石河子 832002;5.教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室,石河子 832002)

·皮膚性病藥物專欄·

大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞的作用*

劉漪淪1,鄧峰美2,劉衛華3,羅永慧1,趙寧寧1,劉海榮3,劉月明1,王航宇4,5

(1.成都醫學院第一附屬醫院燒傷整形外科,成都 610500;2.成都醫學院病理學與病理生理學教研室,成都 610500;3.成都醫學院第一附屬醫院科研實驗中心,成都 610500;4.石河子大學藥學院,石河子 832002;5.教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室,石河子 832002)

目的 探討大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞(HSFs)的作用及其機制。方法分別以終濃度為0,20,40, 80μmol·L-1的大黃素處理HSFs,以MTS法檢測細胞活力,以Annexin V、碘化丙啶雙染法行流式細胞儀檢測,以Western blot法檢測細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)及其磷酸化蛋白、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、髓樣細胞白血病-1(Mcl-1)、受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)的表達。結果大黃素對HSFs的增殖活力有抑制作用,且呈劑量依賴性;HSFs在終濃度為40,80μmol·L-1大黃素作用48 h后死亡率分別為28.6%,68.0%(P＜0.01),以泛caspase抑制藥Z-VAD-FMK預處理能夠部分降低大黃素所致細胞死亡率(P＜0.05);大黃素能夠抑制ERK磷酸化、Mcl-1和RIP1的表達。結論大黃素能夠抑制HSFs的增殖活力、誘導細胞死亡,其機制可能與其抑制ERK1/2磷酸化及Mcl-1、RIP1蛋白表達有關。

大黃素;瘢痕,增生性;成纖維細胞;細胞死亡

增生性瘢痕是創傷后組織過度修復的表現,瘢痕發生的機制至今不明確。臨床上治療有效的藥物主要有糖皮質激素、抗腫瘤藥等,但療效欠佳。從中草藥中篩選出療效確切、副作用小的抑制增生性瘢痕成纖維細胞增殖的有效藥物,具有較大的臨床應用價值。中藥治療增生性瘢痕有悠久的歷史。多種中藥成分能夠在體內或體外模型中抑制瘢痕成纖維細胞的增殖及分泌功能,但多數軟堅散結中藥的藥效成分不明確[1-2]。大黃素(emodin)是多種植物根莖中含有的天然蒽醌衍生物,具有酪氨酸激酶抑制的作用,在一些腫瘤細胞中能夠抑制胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)磷酸化,抑制腫瘤細胞增殖,誘導凋亡[3-4]。研究發現大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSFs)的增殖具有一定抑制作用[5],但機制尚不明確。因此筆者在本實驗中探討大黃素對HSFs的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 達爾伯克改良伊格爾培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、Ⅰ型膠原酶、G418購自美國Gibco公司(批號依次為1255136, 1551835,1374941,1243389,1387741,1444515),中性蛋白酶DispaseⅡ購自Roche公司(批號: 04942078001),大黃素購自Sigma公司(批號:E7881,質量分數＞98%),Z-VAD-FMK(Z-VAD)購自Promega公司(批號:G7231),Annexin V-FITC、碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司(批號:556547),細胞外信號調節激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)及其磷酸化蛋白p-ERK1/2、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的單克隆抗體購自Cell Signaling公司(批號:9107,4370,2876),髓樣細胞白血病-1 (myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)單克隆抗體購自Abcam公司(批號:ab32087),受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein1,RIP1)多克隆抗體購自Santa Cruz公司(批號:sc-7881)。化學發光成像分析系統為日本FUJIFILM公司FUJIFILM LAS-4000,流式細胞儀為美國BD公司AccuriTMC6系統。

1.2 增生性瘢痕成纖維細胞分離培養與實驗分組 經醫院倫理道德與科研委員會批準,患者知情同意后選取深Ⅱ度燒傷后增生性瘢痕患者5例,均為漢族,其中男3例,女2例,年齡23～55歲,均無結締組織疾病及心、肺、肝、腎臟等慢性疾病,未使用過類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物,未接受過放療,傷后3～8個月在我院行瘢痕切除與修復術。瘢痕處于增生期,外觀發紅充血、質硬、高于皮面＞1 cm,表面無破潰,瘢痕局限于皮損區,局部瘙癢。標本取自頸、胸、手部的增生性瘢痕組織,經病理學確診。以0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)將標本洗滌干凈,將組織塊修剪為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,浸泡于0.25%DispaseⅡ中,置于37℃恒溫搖床2 h;然后將組織塊轉入培養皿中,用0.1 mol·L-1PBS洗滌3次,小心剝去表皮,反復洗滌真皮,再用眼科剪將其充分剪碎,約1 mm3大小,接種于培養瓶內,在二氧化碳(CO2)孵箱中培養4～5 h,使其較牢固地粘附于瓶壁,隨后加入含10%FBS的DMEM液,繼續培養,每3 d進行1次換液,待原代細胞生長成單層融合后,按1∶2或1∶3的比例分瓶傳代。實驗時應用第4～6代細胞。根據培養液中加入大黃素的終濃度,設0μmol·L-1(對照組)、20μmol·L-1組、40μmol·L-1組和80μmol·L-1組,同時在進行流式檢測時,設立泛caspase抑制藥Z-VAD-FMK預處理組,在加入不同濃度大黃素之前1 h加入終濃度為20μmol·L-1的ZVAD-FMK。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞活力檢測 將對數生長期的HSFs以每孔5 000個接種于96孔板,24 h后按上述分組進行換液加藥處理,48 h后每孔加入MTS溶液20μL,繼續培養4 h后在酶標儀上測定490 nm吸光度值,并計算相對細胞活力值(樣品吸光度值/對照吸光度值× 100%)。

1.3.2 細胞死亡檢測 采用流式細胞儀,以Annexin V、PI雙染法對細胞進行檢測。選擇對數生長期的細胞,以1×105個·mL-1接種于24孔板,每組設復孔3個,24 h后換液,加入藥物處理,48 h后胰酶消化獲取細胞,移入流式管中,1 500 r·min-1(r=15 cm)離心5 min,棄上清液,預冷PBS每管1 mL洗滌2次,結合緩沖液每管1 mL洗滌1次,每次均1 500 r·min-1(r= 15 cm)離心5 min,結合緩沖液100μL重懸細胞,依次加入Annexin V、PI各5μL,震蕩混勻,靜置15min后加入400μL結合緩沖液,1 h內完成流式檢測。

1.3.3 Western blot法檢測細胞蛋白的表達 各組細胞分別以4×105個接種于6孔板,24 h后胰酶消化,收集細胞于離心管中,預冷PBS洗2次,棄上清液,加入細胞裂解液,冰上孵育30 min,期間震蕩3次, 13 000 r·min-1(r=8 cm)離心30 min,取上清液進行蛋白定量,每樣本取30μg總蛋白量在分離膠濃度為10%的條件下進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)117 V 90～110 min,轉膜50 V 90 min,轉印后的PVDF膜以5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,含聚山梨酯-20的Tris鹽緩沖液(tris buffered saline with tween-20,TBST)洗膜3次,每次20 min,二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,每次20 min,化學發光反應液孵育4 min,透明薄膜密封,以FUJIFILM LAS-4000成像系統進行曝光及定量檢測。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0版統計軟件進行分析,計量數據以均數±標準差(±s)表示,多組間均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對HSFs細胞活力的影響 在終濃度為0 (對照組),20,40及80μmol·L-1大黃素作用下,HSFs相對細胞活力呈現逐漸下降趨勢,其中,大黃素40,80 μmol·L-1組細胞活力下降較為顯著,分別下降達45.2%,79.0%(P＜0.05)。見圖1。

圖1 大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞活力的影響Fig.1 Effect of emodin on cell viability of HSFs

2.2 大黃素對HSFs細胞死亡的誘導作用 流式細胞儀Annexin V、PI雙染檢測的結果顯示,HSFs在終濃度為40,80μmol·L-1大黃素48 h作用下死亡率分別為28.6%,68.0%,高于對照組(P＜0.01),而20μmol·L-1大黃素對HSFs的影響與對照組相比差異無統計學意義。20μmol·L-1Z-VAD-FMK對HSFs的影響同對照組相比,差異無統計學意義;Z-VAD-FMK預處理能夠部分降低大黃素(40,80μmol·L-1組)所致的死亡率(P＜0.05)。流式細胞點陣圖顯示,大黃素40,80μmol·L-1組細胞的死亡,小部分為AnnexinV陽性,提示為早期凋亡;大部分為Annexin V、PI雙陽性,一般認為其存在晚期凋亡或壞死等模式。見圖2。

2.3 大黃素對HSFs ERK1/2磷酸化的作用 Western blot檢測結果顯示,在終濃度為0,20,40, 80μmol·L-1大黃素作用下,ERK1/2的表達無變化, p-ERK1/2的表達出現遞減,蛋白水平依次下降達80.0%(P＜0.01)。見圖3。

2.4 大黃素對HSFs Bcl-2、Mcl-1及RIP1的影響 Bcl-2的表達在不同濃度大黃素作用下沒有顯示出明顯的變化趨勢,而Mcl-1的表達在大黃素(20,40, 80μmol·L-1組)作用下明顯減弱,下降均超過50.0% (P＜0.01),但沒有出現線性的趨勢。RIP1的表達隨著大黃素濃度的增加而逐漸減少,其中,80μmol·L-1組下降超過60.0%(P＜0.01)。見圖4。

3 討論

圖2 Z-VAD-FM K部分抑制大黃素誘導的增生性瘢痕成纖維細胞死亡A.流式細胞儀點陣圖,M即mol·L-1;B.細胞死亡率分析;與大黃素0μmol·L-1組比較,*1P＜0.01;與相應無Z-VAD-FMK組比較,*2P＜0.05Fig.2 Partial inhibition of Z-VAD-FMK on emodin-induced cell death of HSFsA.representative flow cytometry dot plots,M(mol·L-1);B.summary data demonstrating analysis of cell death following a 48 h exposure to the indicated drugs;compared with emodin 0μmol·L-1group,*1P＜0.01;compared with non-Z-VAD-FMK group respectively,*2P＜0.05

圖3 大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞ERK1/2磷酸化的影響Fig.3 Effect of emodin on ERK 1/2 phosphorylation of HSFs

圖4 大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Bcl-2、M cl-1與RIP1表達的影響Fig.4 Effect of em odin on the expression of Bcl-2,M cl-1 and RIP1 of HSFs

大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基)是大黃、虎杖、何首烏、望江南、砂仁及百合等多種中藥中存在的有效成分,分子式為C15H10O5,相對分子質量為270.24。在增生性瘢痕的研究方面,夏珊等[5]發現大黃素能夠阻滯人增生性瘢痕成纖維細胞的細胞周期、抑制細胞增殖,并且促進細胞凋亡,其改變細胞增殖/凋亡的機制可能與細胞內鈣離子(Ca2+)超載有關。作為一種酪氨酸激酶抑制藥,大黃素已被發現能夠抑制ERK1/2磷酸化而發揮抑制多種腫瘤細胞增殖活力的作用,那么其對HSFs是否也存在相應的抑制作用呢?ERK1/2磷酸化,主要通過Ras/Raf/MEK/ERK這一通路來進行,而后者是細胞維持活力、保持增殖穩態的重要環節[6]。若抑制此通路,可抑制細胞生長,最終導致細胞死亡;而過度激活此通路,則可刺激細胞增殖、轉化甚至癌變。本研究表明,大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞ERK1/2磷酸化具有抑制作用,且呈劑量依賴性;另外,與夏珊等[5]研究一致,筆者發現大黃素對HSFs的活力抑制亦存在劑量依賴性。表明大黃素對HSFs的抑制可能與其抑制ERK1/2磷酸化水平有關。

大黃素在化學結構上和多柔比星、柔紅霉素等抗癌藥物一樣,同屬于蒽醌類化合物,對某些腫瘤細胞系如肺癌細胞、肝癌細胞等,具有一定的誘導凋亡的作用[7-9],結合上述大黃素在抑制ERK1/2磷酸化方面的作用,筆者認為大黃素對細胞死亡的誘導是一個復雜的多種機制并存的體系。細胞的程序性死亡是目前人們較為關注的方向,包括凋亡、程序性壞死等。本研究一方面通過PI、Annexin V雙染法初步判斷細胞早期凋亡或壞死的情況,同時應用泛caspase抑制藥-Z-VADFMK,一種凋亡抑制劑[10],進一步分析細胞死亡的形式;另一方面,筆者選擇Bcl-2、Mcl-1這兩個常見的抗凋亡蛋白以及RIP1這一與細胞程序性壞死相關的蛋白進行檢測,初步探討大黃素誘導HSFs死亡過程可能的機制。結果表明,大黃素所致的死亡細胞中,小部分呈Annexin V陽性,提示其早期凋亡,而大部分為PI、Annexin V雙陽性,認為存在晚期凋亡或壞死等可能[11-13]。而Z-VAD-FMK對大黃素組細胞進行預處理,在40和80μmol·L-1組,均部分阻斷細胞的死亡。這兩方面證據提示大黃素導致的細胞死亡不僅僅只有細胞凋亡,還包含其他死亡模式。

Bcl-2與Mcl-1是Bcl-2家族的成員,具有抗凋亡的作用[14-15]。在本實驗中,大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Mcl-1的表達起到抑制作用,而對Bcl-2的表達并沒有表現出有意義的調控作用,提示大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡誘導可能與Mcl-1的調控有關。在本實驗中大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Mcl-1表達的抑制無劑量依賴的關系,可能是由于大黃素作用濃度的范圍或者是其他因素造成,需要進一步證實。

RIP1是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細胞存活及細胞程序性壞死等信號傳導中起重要作用,研究發現,RIP1是決定細胞生死的重要節點[16]。在本實驗中,增生性瘢痕成纖維細胞RIP1的表達,在大黃素的作用下表現出劑量依賴性的抑制,提示大黃素對增生性瘢痕成纖維細胞的死亡誘導作用與RIP1的改變具有一定關聯,這對今后研究大黃素的作用具有很大的啟發。另外,p-ERK1/2與RIP1的變化呈現相同的劑量依賴性趨勢,它們之間存在什么樣的調控關系值得進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.007

Effect of Emodin on Hypertrophic Scar Fibroblasts

LIU Yi-lun1,DENG Feng-mei2,LIUWei-hua3,LUO Yong-hui1,ZHAO Ning-ning1,LIU Hai-rong3,LIU Yueming1,WANG Hang-yu4,5
(1.Department of Burns and Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;2.Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;3.Experiment Research Center,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500,China;4.School ofPharmacy,Shihezi University,Shihezi 832002,China;5.Key Laboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM,Shihezi 832002,China)

Objective To investigate the effect of emodin on hypertrophic scar fibroblasts(HSFs)and explore the underlyingmechanism.MethodsHSFs were treated by emodin at final concentrations of 0,20,40,and 80μmol·L-1, respectively,in the culturalmedia.Forty-eight hours later,the cells were subjected to MTS assay and flow cytometry assay with annexin V and propidium iodide as dyeing indicators.Whole cell lysates from the cells of every group were subjected to Western blotting tomeasure the protein expression levels of ERK1/2,Bcl-2,Mcl-1 and RIP1.ResultsThe cell viability of HSFs was inhibited by emodin in a dose dependentmanner.Themortality rate of HSFs treated with emodin for48 h at the concentrations of 40 and 80μmol·L-1were 28.6%and 68.0%,respectively,which was significantly higher than that of the control group(P＜0.01).Pretreatmentwith Z-VAD-FMK could partially reduce the mortality caused by emodin(P＜0.05).Phosphorylation of ERK1/2 and the expression of RIP1 and Mcl-1 were inhibited by emodin.ConclusionDown regulation of ERK1/2,RIP1 and Mcl-1 by emodin may account for the inhibited proliferation and increased cell death of HSFs.

Emodin;Scar,hypertrophic;Fibroblast;Cell death

R285.6;R619.6

A

1004-0781(2014)12-1566-05

2014-06-23

2014-08-13

*國家自然科學基金資助面上項目( 30672175);四川省衛生廳科研項目(100103);成都醫學院第一附屬醫院燒傷外科學四川省醫學重點學科專項科研基金資助項目(SSZDXK-001)

劉漪淪(1972-),男,安徽霍邱人,副主任醫師,副教授,碩士,研究方向:瘢痕防治與組織再生。電話:(0) 18227672279,E-mail:thirdforce@163.com。

王航宇(1968-),男,新疆石河子人,副教授,碩士,研究方向:中藥和天然藥物研究。電話:(0)18909932852, E-mail:18909932852@189.cn。