高效液相色譜法測定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

張麗珍,周之榮

(1.廣東藥學院附屬門診部,廣州 510240;2.廣東藥學院公共衛生學院衛生檢驗與衛生化學系,廣州 510310; 3.廣東省分子流行病學重點實驗室,廣州 510310)

高效液相色譜法測定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

張麗珍1,周之榮2,3

(1.廣東藥學院附屬門診部,廣州 510240;2.廣東藥學院公共衛生學院衛生檢驗與衛生化學系,廣州 510310; 3.廣東省分子流行病學重點實驗室,廣州 510310)

目的 建立同時測定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。方法采用高效液相色譜法(HPLC):色譜條件為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)色譜柱分離,檢測波長為290 nm,流動相為乙腈-水進行梯度洗脫,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30℃,理論板數不低于3 000。結果桂皮醛進樣量在0.025～0.500μg,橙皮苷進樣量在0.10～2.00μg范圍內與峰面積積分值線性關系均良好;在精密度實驗、穩定性實驗、重復性實驗中,桂皮醛和橙皮苷峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.16%和1.03%,1.27%和1.08%,1.23%和1.28%;桂皮醛的平均加樣回收率為99.24%,RSD為1.65%(n=9),橙皮苷的平均加樣回收率為99.39%,RSD為1.85%(n=9)。結論該方法具有良好的專屬性和重復性,加樣回收率實驗符合要求,能準確、穩定地對四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量進行定量測定,可作為該制劑的質量控制方法。

四味清口含片;桂皮醛;橙皮苷;色譜法,高效液相;含量測定

四味清口含片處方源于《華佗神方》,由桂心、甘草、細辛、廣陳皮組成。該方理氣和胃,陽通胃氣和降,芳香化濁除臭,具有防治口臭等功效[1]。由于處方中有幾味中藥的口感不好,為方便患者服用,豐富臨床用藥劑型,本課題組研制了能在口腔內緩緩溶化而發揮對口臭治療作用的口含片[2]。方中桂心為君藥,桂心為肉桂加工過程中檢下的邊條除去栓皮者,主要含揮發油桂皮醛等成分。廣陳皮主要成分為橙皮苷、新橙皮苷、對羥福林、黃酮化合物、揮發油等。桂心中的桂皮醛含量測定方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[3]、氣相色譜(gas chromatography,GC)[4]、薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[5];廣陳皮中的橙皮苷含量測定方法有HPLC[6]、超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)[7]、TLC[8]。為有效控制四味清口含片產品質量,保證其用藥安全有效,采用HPLC建立該制劑主藥桂心所含主要有效成分桂皮醛和廣陳皮中橙皮苷含量的同時測定方法,并對3批樣品進行了含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相自動進樣色譜儀,紫外檢測器(Dionex公司);CPA225D電子分析天平(Sartorius公司);KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);U-3010型紫外-可見分光光度計(日本日立公司)。

1.2 試藥 四味清口含片(批號:20130501, 20130510,20130520)由本實驗室自制;桂皮醛對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110710-201012,純度:≥99.5%);橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110721-200613,純度:≥98.5%);甲醇、乙腈為色譜醇。實驗用水為雙蒸水;所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定指標的確定 選擇桂皮醛、橙皮苷作為四味清口含片質量控制的指標成分進行定量研究,建立HPLC同時測定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。

2.2 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-SP(4.6 mm× 150 mm,5μm);流動相:乙腈(A)和水(B),梯度洗脫(0～5 min:28%A;～10 min:28%A→35%A;～18 min:65%A;～20 min:35%A→28%A);檢測波長290 nm;流速1.0 mL·min-1;柱溫:30℃。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取置五氧化二磷(P2O5)干燥器中放置24 h的桂皮醛、橙皮苷對照品適量,置棕色量瓶中,加甲醇使完全溶解,制成含桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合儲備液。精密量取儲備液配成每毫升中含桂皮醛20μg和含橙皮苷80μg的溶液,作為混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取本品10片,研細,過4號篩,取約0.3 g,精密稱定。置棕色瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定質量,超聲提取(功率250W,頻率40 kHz) 20 min,放冷,再稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2.5 陰性對照溶液的制備

2.5.1 缺桂心陰性對照溶液的制備 取處方中除桂心外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺桂心陰性樣品,稱取0.3 g,按“2.4”項下方法制備,即得。

2.5.2 缺廣陳皮陰性對照溶液的制備 取處方中除廣陳皮外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺廣陳皮陰性樣品,稱取0.3 g,精密稱定。按照“2.4”項下方法制備,即得。

2.5.3 缺桂心和廣陳皮陰性對照溶液的制備 取處方中除桂心和廣陳皮外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺桂心和廣陳皮陰性樣品,稱取0.3 g,精密稱定。按“2.4”項下方法制備,即得。

2.6 系統適應性實驗 分別精密吸取混合對照品、供試品、缺桂心陰性對照溶液、缺廣陳皮陰性對照溶液、缺桂心和廣陳皮陰性對照溶液各10μL,按“2.2”項條件進樣。在該色譜條件下,桂皮醛與橙皮苷和其他成分可達基線分離,桂皮醛和橙皮苷保留時間分別為15.2和3.9 min,理論板數不低于3 000,各成分分離度均＞1.5;不含廣陳皮陰性對照溶液在橙皮苷出峰區間未出現相應色譜峰,不含桂心陰性對照溶液在桂皮醛出峰區間未出現相應色譜峰,不含桂心和廣陳皮陰性對照溶液在桂皮醛、橙皮苷出峰區間未出現相應色譜峰。表明該方法專屬性較好,陰性對照無干擾。色譜圖結果見圖1。

2.7 方法學考察

2.7.1 線性范圍的考察 精密量取混合對照品儲備液適量,用甲醇稀釋制成濃度為含桂皮醛分別為2.50, 5.00,10.00,20.00,30.00,40.00,50.00μg·mL-1的系列對照品溶液(橙皮苷含量分別為10.0,20.0, 40.0,80.0,120.0,160.0,200.0μg·mL-1),搖勻。在“2.2”項條件下進樣10μL,記錄各色譜峰峰面積;以峰面積均值為縱坐標(Y)、進樣量(μg)為橫坐標(X),繪制標準曲線,得桂皮醛回歸方程Y=4 148.534X+ 40.763,r=0.999 7,橙皮苷回歸方程Y=2 304.509X+ 126.348,r=0.999 9。結果顯示,桂皮醛進樣量在0.025～0.500μg、橙皮苷進樣量在0.10～2.00μg范圍內與峰面積有良好的線性關系。

2.7.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液10μL,在“2.2”項條件下平行測定6次,記錄桂皮醛和橙皮苷峰面積,平均峰面積分別為862.90, 1 980.82,其RSD分別為為1.16%,1.03%,表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩定性實驗 精密吸取同一批(批號: 20130501)供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件,分別于0,5,6.5,8,9,12 h進樣10μL,測定記錄峰面積,計算相對標準偏差。結果供試品溶液的桂皮醛平均質量分數為3.27 mg·g-1,RSD為1.27%;橙皮苷平均質量分數為13.01 mg·g-1,RSD為1.08%,表明供試品溶液中的桂皮醛和橙皮苷均能夠在12 h內保持穩定。

2.7.4 重復性實驗 取同一批樣品(批號: 20130501),共取6份、各約0.3 g,精密稱定。按“2.4”項下方法制備供試品溶液,平行操作6份,按“2.2”項下色譜條件,測定峰面積并計算含量。結果桂皮醛平均質量分數為3.27 mg·g-1,RSD為1.23%;橙皮苷平均質量分數為13.01 mg·g-1,RSD為1.28%,表明重復性良好。

A.缺廣陳皮和桂心陰性對照品;B.缺桂心陰性對照品;C.缺廣陳皮陰性對照品;D.桂皮醛和橙皮苷對照品;E.供試品;1.橙皮苷;2.桂皮醛圖1 四味清口含片中桂皮醛的和橙皮苷的HPLC圖A.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;B.negative reference substance without Cortex Cinnamomi;C.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum;D.reference substance of Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;E.sample;1. hesperidin;2.cinnamaldehydeFig.1 HPLC chromatograms of cinnamaldehyde and hesperidin in siweiqing buccal tablets

2.7.5 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批號(20130501)四味清口含片(約相當于桂皮醛3.27 mg·g-1、橙皮苷13.01 mg·g-1)適量,研細,混勻,取約0.25 g,精密稱定,平行取9份,分別置于50 mL棕色量瓶中,再分別精密加入桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合儲備液2.0,2.0,2.0,4.0,4.0,4.0,6.0,6.0,6.0 mL,續加甲醇適量,超聲處理20 min,取出,放置至室溫,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得加樣回收供試品溶液;分別精密吸取10μL,按“2.2”項下色譜條件測定,計算桂皮醛和橙皮苷回收率。桂皮醛的加樣回收率為97.75%～102.02%,平均值為99.24%,RSD為1.65%(n=9),橙皮苷的加樣回收率97.36%～102.42%,平均值為99.39%,RSD為1.85%(n=9)。

2.8 樣品含量測定 取3批四味清口含片樣品(批號:20130501,20130510,20130520),分別按照“2.4”項下方法制備供試品溶液,每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項下條件測定,計算桂皮醛和橙皮苷含量。結果3批四味清口含片樣品中桂皮醛含量分別為每片1.63,1.64,1.64 mg,橙皮苷含量分別為每片6.50, 6.51,6.51 mg。

3 討論

3.1 測定波長的選擇 桂皮醛在290 nm波長處有最大吸收,在220～320 nm波長之間均有吸收,在波長250 nm處吸收比較平滑;橙皮苷在283 nm波長處有最大吸收,為了兼顧桂皮醛和橙皮苷的同時測定,本方法在290 nm波長下測定,橙皮苷的靈敏度也可以滿足準確測定的要求。故選擇290 nm為檢測波長。

3.2 提取方式的選擇 待測成分桂皮醛屬于易揮發性物質,所以提取方式未考慮熱提取法(如回流提取、索氏提取等),文獻[3,9]報道的提取方式也以超聲提取為主。實驗中對提取時間(20,30,40 min)、超聲波儀器的功率和頻率、是否過夜等不同影響因素進行逐一考察,結果顯示:若超聲處理1次,則以20 min為佳,原因是隨著超聲處理時間的延長,提取液溫度會有一定程度地升高,已提取出的桂皮醛會部分揮發逸失。超聲波儀器的功率對提取效率影響不大,功率高則提取效率稍高(約3.5%)。《中華人民共和國藥典》2010年版肉桂項下供試品溶液的制備采用“超聲-放置過夜-超聲”的處理方式。本次實驗也將該方法的提取效果與直接超聲提取一次進行比較,結果“超聲-放置過夜-超聲”方式的提取效率只相當于直接超聲提取一次的89%。《中華人民共和國藥典》2010年版方法測定肉桂中的桂皮醛,放置過夜的目的是為了使溶劑充分滲入藥材的組織細胞內部而使桂皮醛充分溶出;而四味清口含片中的桂皮醛則存在于揮發油的β-環糊精包合物中,超聲(功率250 W,頻率40 kHz) 20 min足以使其完全溶出,放置過夜反而會導致桂皮醛逸失而使測定結果偏低。綜合上述因素,選擇超聲處理20 min提取桂皮醛,橙皮苷的回收率也能達到要求。

3.3 流動相的選擇 本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-醋酸-水系統,結果表明以乙腈-水為流動相梯度洗脫,可以使桂皮醛和橙皮苷的分離良好,峰形也較理想。

3.4 桂皮醛的使用操作 桂皮醛對光線敏感[10],在實驗過程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在陰涼處避光,快速操作。

筆者所建立的含量測定方法具有良好的精密度、準確性和重復性,專屬性好,可用于四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量測定,可作為該制劑的質量控制方法。

[1] 楊金生,趙美麗校注.華佗神方[M].北京:中醫古籍出版社,2002:119.

[2] 張麗珍,詹曉如,胡奕勤,等.四味清口含片處方的優化及制備工藝研究[J].中國醫藥科學,2013,3(21):51-56.

[3] 徐志紅,陳磊垚,劉欣怡.小青龍貼中桂皮醛含量測定的研究[J].世界中西醫結合雜志,2013,8(6):576-577.

[4] 李啟艷,朱日然.GC測定陽和膠囊中桂皮醛的含量[J].中成藥,2006,28(1):150-151.

[5] 任孝德.劉杰.薄層掃描法測定牽正膏中桂皮醛的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2004,15(2):120-121,127.

[6] 鄭國棟,蔣林,楊得坡,等.HPLC法同時測定不同產地廣陳皮中5種活性黃酮成分[J].中草藥,2010,41(4): 652-655.

[7] 李志輝,肖暉,孟軍華,等.超高效液相色譜法同時測定柑橘屬類藥材中4種黃酮類成分[J].中國醫院藥學雜志,2012,32(20):1683-1685.

[8] 周芳,鄭國棟,蔣林,等.薄層掃描法同時測定廣陳皮中三種黃酮化合物的含量[J].中藥材,2009,32(6):911-913.

[9] 馮尚紅,劉海紅,虎延龍.HPLC法測定十味黑冰片丸中桂皮醛的含量[J].北方藥學,2013,10(5):12-13.

[10] 馬蓉蓉,唐意紅,孫兆林,等.RP-HPLC測定不同產地肉桂中桂皮醛和肉桂酸的含量[J].中國現代中藥,2008, 10(4):9-11.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.023

Determ ination of Cinnamaldehyde and Hesperidin in Siweiqing Buccal Tablets by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Li-zhen1,ZHOU Zhi-rong2,3
(1.The Clinic Attached to Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510240,China;2.Department ofSanitary Analysisand Sanitary Chemistry,School ofPublic Health, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510310,China;3.Guangdong Key Laboratory of Molecular Epidemiology,Guangzhou 510310,China)

Objective To establish a method for the determination of hesperidin and cinnamaldehyde insiweiqingbuccal tablets.MethodsA high performance liquid chromatography(HPLC)method was established.The chromatographic conditions were as follows:the chromatographic column Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)with the mixture of acetonitrile and water asmobile phase in gradientmode,the detection wavelength of290 nm,the flow rate of1.0 mL·min-1,the column temperature of30℃,the theoretical plate number no less than 3 000.ResultsThe linear relationship between content and peak area was obtained in the range of 0.025-0.500μg for cinnamaldehyde and 0.10-2.00μg for hesperidin.RSD of the peak area of cinnamaldehyde and hesperidin for the precision test,the stability test and the repeatability test were 1.16%and 1.03%,1.27%and 1.08%,1.23%and 1.28%,respectively.The average recovery of cinnamaldehyde was 99.24%with RSD of 1.65%(n=9).The average recovery of hesperidin was99.39%with RSD of1.85%(n=9).ConclusionThemethod can be applied to quantitative assay of cinnamaldehyde and hesperidin insiweiqingbuccal tablets with good reproducibility and specificity.The recovery resultmet the acceptance criteria.The method can effectively control the quality ofsiweiqingbuccal tablets with good specificity,reproducibility and stability,and can be applied to the quality control ofsiweiqingbuccal tablets.

Siweiqingbuccal tablets;Hesperidin;Cinnamaldehyde;Chromatography,high performance liquid;Content determination

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1627-04

2014-01-02

2014-02-01

*廣東省中醫藥局項目(20122109)

張麗珍(1963-),女,江西東鄉人,副主任中藥師,主要從事中草藥提取、分析測定研究工作。電話:020-34074636,E-mail:gzzlzhang@163.com。

周之榮(1965-),男,四川南充人,教授,碩士,研究方向:環境分析化學。電話:020-34055201,E-mail: zhouzhirong1965@sina.com。