雙黃連聯用左氧氟沙星對兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213耐藥性的影響*

王國俊,葉云,馮碧敏,李虹

(瀘州醫學院 1.附屬醫院藥劑科;2.藥學院,瀘州 646000)

雙黃連聯用左氧氟沙星對兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213耐藥性的影響*

王國俊1,葉云1,馮碧敏1,李虹2

(瀘州醫學院 1.附屬醫院藥劑科;2.藥學院,瀘州 646000)

目的 探討雙黃連聯合左氧氟沙星對兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213對左氧氟沙星的耐藥性的影響。方法建立兔組織籠感染模型,分別用左氧氟沙星單獨處理(A組)及雙黃連聯合左氧氟沙星處理(B組)5 d,探討兔組織籠感染模型中左氧氟沙星在組織液中穩態濃度及經處理后兔組織籠中細菌恢復生長的情況和細菌耐藥性變化。結果兩組左氧氟沙星在組織液中濃度差異無統計學意義。B組兔組織籠內細菌恢復生長發生率(20%)明顯低于A組(100.0%),而左氧氟沙星對B組兔組織籠內細菌的最低抑菌濃度(MIC)值明顯低于A組。結論雙黃連與左氧氟沙星聯合治療有助于減少金黃色葡萄球菌對左氧氟沙星的耐藥現象,提示中藥聯合抗菌藥物可降低細菌對抗菌藥物的耐藥性。

雙黃連;左氧氟沙星;金黃色葡萄球菌;耐藥性;模型,兔組織籠感染

細菌等病原微生物感染一直是威脅人類健康的重要疾病之一。左氧氟沙星(levofloxacin,LVLX)為氟喹諾酮類抗菌藥物,具有廣譜、高效的抗菌活性,臨床應用廣泛。然而近年來細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥現象日益嚴重。由于自然界中存在的天然耐藥菌只占少數,難以與占大多數的優勢敏感菌競爭,只有敏感菌因抗菌藥物的選擇作用而被大量殺滅后,耐藥菌才能大量繁殖成為優勢菌而產生耐藥。耐藥突變選擇窗(mutant selection window,MSW)是最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)與防耐藥變異濃度(mutant prevention concent ration,MPC)之間的濃度范圍,在此范圍內,耐藥菌株可以被選擇性富集。MSW越寬,越容易出現耐藥菌株;反之,MSW越窄,產生耐藥菌株的可能性越小。MPC提供了抗菌藥物治療中嚴格限制突變菌株被選擇性擴增的抗菌藥物濃度閾值,藥物濃度高于該閾值可有效避免耐藥菌株的選擇性富集。對于多數氟喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星,其MPC遠大于MIC,要獲得血清或組織藥物濃度超過MPC很困難[1-2],因此容易導致細菌耐藥性產生。

研究表明即使藥物各自都有非常高的MPC,不同作用機制的抗菌藥物聯合應用也可縮小或關閉MSW,從而有效的延緩細菌耐藥性的產生[3]。但中藥與抗菌藥物聯合應用對于細菌MSW的作用筆者鮮見報道。筆者通過體外研究發現雙黃連和左氧氟沙星聯合用藥有同上述研究結論一致的結果,可使左氧氟沙星對金黃色葡萄球菌(金葡菌)ATCC29213的MSW縮小[4],提示二者聯用有利于減少細菌耐藥性產生。但二者聯用的體內研究筆者尚未見報道。筆者通過建立兔組織籠感染模型,考察雙黃連粉針與左氧氟沙星聯合應用對金葡菌ATCC29213耐藥性的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 普通級成年健康家兔,雌雄各半,體質量2.5～3.0 kg,由瀘州醫學院實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(川)2008-065,合格證號:川醫動2401115。

1.2 試藥 雙黃連粉針(哈藥集團中藥二廠生產,規格:每支600 mg,批號:1003015);鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液(揚子江藥業集團有限公司生產,規格: 0.3 g∶100 mL,批號:11061631);注射用青霉素鈉(華北制藥廠生產,規格:80萬U,批號:09013025);3%戊巴比妥鈉(湖北遠成藥業有限公司生產,規格:每支0.1 g,批號:YC10000);左氧氟沙星標準品(中國食品藥品檢定研究院,批號:130455-201005,純度: 97.3%);加替沙星(中國食品藥品檢定研究院,批號: 130518-200402,純度:97.2%);Mueller.Hinton(MH)肉湯、MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司,批號: 100804);乙腈為色譜純;磷酸二氫鉀為分析純。

1.3 實驗器材 離心機(長沙英泰儀器有限公司,型號:A130102);渦旋混合器(杭州賽智科技有限公司,型號:ST-0246);高效液相色譜儀(型號:UltiMate 3000,戴安,二極管陣列檢測器),色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);二氧化碳(CO2)培養箱(上海一恒科技有限公司,型號:HH.CP-01);無菌的多孔、中空的高爾夫練習球(直徑43 mm)。

1.4 菌株 金葡菌ATCC29213,中國食品藥品檢定研究院提供。

1.5 左氧氟沙星對金葡菌ATCC29213的MIC、MPC測定 采用瓊脂平板稀釋法,具體見筆者以前的報道[4]。

1.6 兔組織籠感染模型的建立 成年健康家兔15只,背部去毛,3%戊巴比妥鈉麻醉,皮膚聚維酮碘消毒,皮下植入高爾夫練習球1個。2周后手術傷口愈合,4周后,高爾夫練習球內已充滿清亮的組織液,實驗前一天,用無菌注射器抽取球內液體0.5 mL,取100 μL接種于MH瓊脂平板上,37℃過夜培養,經檢驗無菌后,用于建立感染模型。用無菌注射器往高爾夫練習球內注入1.2×1010CFU對數生長期金葡菌ATCC29213。2 d后抽取球內組織液0.5 mL進行細菌菌落計數,細菌濃度在1×108CFU·mL-1以上者用于實驗(經測定,15只兔組織液中細菌數目全部符合要求)。感染3 d后開始分組處理[5]。

1.7 給藥方法 15只實驗動物隨機分為3組,每組各5只。A組:單獨給予左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1; B組:給予注射左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1后再給予雙黃連粉針92 mg·kg-1·d-1;陰性對照組:給予相應量的0.9%氯化鈉溶液。均為耳緣靜脈注射,連續給藥5 d[6]。

1.8 兔組織籠感染模型中感染部位左氧氟沙星濃度測定 第5天給藥后2,4,6,8,10 h末取組織液0.35 mL,加入4 μg·mL-1內標加替沙星50 μL,15%高氯酸蛋白沉淀劑100 μL,渦旋振蕩1 min, 12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,采用高效液相色譜法測定組織液中左氧氟沙星濃度。色譜條件: Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀∶乙腈(80∶20),用磷酸調至pH4.5,流速1 mL·min-1,紫外檢測波長294 nm,柱溫30℃,進樣量20 μL[7]。

1.9 兔組織籠感染模型中金葡菌MIC測定 上述各組處理結束后48 h抽取組織籠中組織液20 μL,置于培養基中,37℃增菌,觀察細菌恢復生長的情況,對恢復生長細菌按美國臨床實驗室標準化委員會推薦的標準測定其左氧氟沙星的MIC。

1.10 統計學方法 不同處理組藥物濃度及金葡菌的MIC比較采用兩個樣本均數比較的t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外測定 左氧氟沙星對金葡菌的MIC為0.13 μg·mL-1,MPC為1.30 μg·mL-1,其MSW為0. 13～1.30 μg·mL-1。

2.2 不同時間兔組織籠感染模型組織液中左氧氟沙星的濃度 由表1可知:A組與B組在給藥10 h后組織液中左氧氟沙星的濃度開始低于0.13 μg·mL-1,在給藥2 h至給藥8 h后,兔組織液中的左氧氟沙星均略大于0.13 μg·mL-1,兔組織液中左氧氟沙星濃度至少有25%時間處于其MSW(0.13～1.30 μg·mL-1)內的,其tmsw(tmsw:藥物濃度在MSW內的時間)＞25%。經統計學檢驗表明A組與B組左氧氟沙星組織液濃度差異無統計學意義(P＞0.05)。表明兔組織液中金葡菌耐藥情況的差異并非由于左氧氟沙星濃度差異所致。

表1 不同時間點兩組兔組織液中左氧氟沙星的濃度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

表1 不同時間點兩組兔組織液中左氧氟沙星的濃度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

組別家兔/只組織液中左氧氟沙星濃度2 h4 h6 h8 h10 h A組50.193±0.0610.180±0.0280.174±0.0260.186±0.0290.092±0.016 B組50.185±0.0450.152±0.0190.169±0.0250.160±0.0250.093±0.024

2.3 不同治療組兔組織籠內細菌恢復生長比率 陰性對照組5只家兔組織液抽取培養后均有細菌生長,A組單用左氧氟沙星處理的5只家兔組織籠內細菌在處理結束后均恢復生長,而B組雙黃連聯用左氧氟沙星處理的5只家兔僅出現了1例細菌恢復生長。單用左氧氟沙星處理的家兔細菌恢復生長發生率(100.0%)明顯高于雙黃連聯用左氧氟沙星處理后的家兔細菌恢復生長率(20.0%)。

2.4 兔組織籠內細菌的耐藥性變化 A組5只家兔組織液中恢復生長的細菌左氧氟沙星對其的MIC均有明顯升高,MIC為(0.73±0.29)μg·mL-1;B組僅有1只兔中組織液有細菌恢復生長,升高為原金葡菌ATCC29213的2MIC,其余4只家兔組織籠內未出現細菌恢復生長。將被殺死的金葡菌MIC計為原金葡菌ATCC29213的MIC(0.13 μg·mL-1),得MIC為(0.16±0.06)μg·mL-1。A組的恢復生長細菌左氧氟沙星MIC顯著高于B組MIC(P＜0.05)。

3 討論

模擬研究人體的兔組織籠模型常用于測定藥物的組織分布等研究,運用感染性家兔模型進行藥物動力學研究,可觀察藥物在特定感染組織中的藥效學,也可用于抗菌藥物間在感染條件下的療效比較[8],因此本文建立兔組織籠感染模型用于研究家兔感染部位組織液中藥物濃度。

FIRSOV等[9]研究表明,當氟喹諾酮藥物tmsw＞20%治療時間時,金葡菌的耐藥突變菌株容易被選擇性富集擴增,從而導致MIC提高。當tmsw≤20%治療時間時,MIC無變化。藥物濃度在MSW的不同位置,對出現耐藥的時間及耐藥程度均具有明顯的影響。且藥物濃度在MSW的下部時,更容易選擇出耐藥突變菌株。本實驗中A組與B組兔組織液中左氧氟沙星的tmsw＞20%,均位于MSW的下部且兩組家兔組織液中左氧氟沙星濃度差異無統計學意義。表明兩組中左氧氟沙星均處于容易選擇出耐藥突變菌株的濃度,且兔組織液中金葡菌耐藥情況的差異并非由于左氧氟沙星濃度差異所致。

MSW理論認為當兩種不同作用機制的藥物聯合用藥,并同時處于各自的MIC之上時,病原菌必須同時發生兩種耐藥突變才能生長,因此即使這些藥物各自都有非常高的MPC,也不會產生耐藥突變。上述兔組織籠感染模型單用左氧氟沙星組(A組)停止給藥后出現了5例細菌恢復生長,而雙黃連聯用左氧氟沙星組(B組)僅出現了1例細菌恢復生長。測定各組組織液中恢復生長的金黃色葡萄球菌MIC可知,雙黃連聯用左氧氟沙星組細菌MIC與單用左氧氟沙星組細菌MIC比較差異有統計學意義(P＜0.05)。提示單用左氧氟沙星治療感染,藥物濃度在MSW內易誘導細菌出現耐藥,而具有抗菌作用的中藥與左氧氟沙星聯用有助于提高治療效果并減少細菌對左氧氟沙星的耐藥現象,但由于動物體內研究具有一定的局限性,上述結論尚需更深入研究及臨床加以驗證。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.006

Effect of Shuanghuanglian Combined with Levofloxacin on Antibiotic Resistance of Staphylococcus Aureus ATCC29213 in Rabbit Tissue Cage Infection Model

WANG Guo-jun1,YE Yun1,FENG Bi-min1,LI Hong2
(1.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital;2. the Pharmaceutical School,Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China)

Objective To explore effects ofshuanghuangliancombined with levofloxacin on antibiotic resistance ofStaphylococcus AureusATCC29213 to levofloxacin.MethodsTissue cage infection model withStaphylococcus aureuswas established in rabbits,and the infected animals were given with levofloxacin alone(group A)or in combination withshuanghuanglian(group B)for 5 days respectively.Steady-state concentration of levofloxacin in tissue cage,bacteria recovery and bacterial resistance in tissue cage infection model were studied.ResultsSteady-state concentration of levofloxacin in tissue cage was not significantly different between group A and group B.The recovery rate of bacteria was significantly lower in group B than in group A(20.0%vs.100.0%).The minimum inhibitory concentration(MIC)was lower in group B than in group A.ConclusionShuanghuangliancombined with levofloxacin is helpful to reduce antibiotic resistance ofStaphylococcus aureusto levofloxacin,indicating that some Chinese traditional medicine combined with antibiotics can reduce antibiotic resistance.

Shuanghuanglian;Levofloxacin;Staphylococcus aureus;Antibiotic resistance;Model,rabbit tissue cage infection

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-1001-04

2013-03-27

2014-01-10

*楊森科學研究委員會中國分會研究基金資助項目(JRCC2011藥理02);瀘州醫學院青年基金資助項目(瀘醫院科[2009]1號)

王國俊(1975-),女,四川瀘州人,副主任藥師,碩士,研究方向:臨床藥學。電話:0830-3165750,E-mail: wanggj7532@163.com。

葉云(1963-),男,四川瀘州人,教授,學士,研究方向:臨床藥學。電話:0830-3165750,E-mail:yeyun8622@ 163.com。