諾考達唑抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用及機制*

李丹,郭小梅

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科,武漢 430030)

諾考達唑抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用及機制*

李丹,郭小梅

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科,武漢 430030)

目的 研究諾考達唑抑制大鼠血管平滑肌細胞(rVSMCs)的作用及機制。方法將rVSMCs分為A、B、C、D 4組,A組常規培養,B組無血清培養24 h,C組無血清培養48 h后常規培養18 h,D組先后加入胸腺嘧啶核苷(工作濃度為0.05 g·mL-1)作用12 h后再加入諾考達唑(工作濃度為0.05 g·mL-1)繼續維持12 h。分別進行細胞周期的檢測,觀察細胞超微結構的變化,檢測糖代謝、氨基酸代謝與ATP以及NAD/NADH的變化以及線粒體融合蛋白2(Mfn-2)的表達。結果流式細胞術檢測結果顯示B、C、D組細胞分別阻滯于G0/G1期,S期及G2/M期。電子顯微鏡檢測顯示D組線粒體的數量減少,體積縮小。D組與A組及C組相比,糖代謝、氨基酸代謝均顯著降低,ATP的產生明顯減少, NADH的生成顯著增加(P＜0.05)。Western Blot示G2/M期細胞阻滯與諾考達唑均可導致Mfn-2表達增高(P＜0.05)。結論諾考達唑可明顯降低rVSMCs能量代謝,阻斷rVSMCs的增殖狀態,可能與Mfn-2抗動脈粥樣硬化的作用有關。

諾考達唑;增殖,血管平滑肌細胞;大鼠;代謝,能量;線粒體融合蛋白-2;動脈粥樣硬化

經皮冠狀動脈內介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)術后再狹窄嚴重影響冠心病患者的預后,血管壁的損傷、炎癥以及血管平滑肌的增殖是造成血管再狹窄的主要因素,其中血管平滑肌的增殖是關鍵因素,因此阻止血管平滑肌的異常增殖,預防PCI術后再狹窄,對改善患者預后具有重要的意義。筆者在本研究中首次發現諾考達唑可有效降低大鼠血管平滑肌細胞(rat vascular smooth muscle cells,rVSMCs)能量代謝,阻斷rVSMCs的增殖狀態,可為探索調控rVSMCs的異常增殖與分化提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 細胞 Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(rVSMCs),由美國國立衛生研究院提供。

1.2 主要試劑 諾考達唑、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、RNase A(美國Sigma公司,批號:M1404, P4170,R6513);糖氧化水平定量試劑盒(美國,BioAssay Systems,批號:DIGL-100)、L-氨基酸定量檢測試劑盒(美國,BioVision,批號:K639-100)、ATP比色測定試劑盒(美國,BioVision,批號:K354-100)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD/NADH)檢測試劑盒(美國,BioAssay System,批號:E2ND-100、ECNP-100);兔抗線粒體融合蛋白2抗體(美國,abcam,批號ab50483)。

1.3 主要儀器 YT-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);Heal force二氧化碳細胞培養箱(香港力康公司);Millipore超純水制備機(美國Millipore公司);低速/低溫超高速離心機(美國Sigma公司); FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司);超薄切片機(德國LEICA ULTRACUT UCT);透射電鏡(荷蘭FEI Tecnai G212型);ELX-800酶標儀(美國Bio-Tek公司);電泳轉膜設備(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實驗分組 A組:Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞,實驗選擇3～5代處于對數生長期的細胞,采用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)在37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養,細胞生長約50%豐度時進行以下處理。B組為換DMEM高糖培養基(不含血清)同步化培養24 h;C組為DMEM高糖培養基(不含血清)同步化培養48 h,接著常規培養18 h;D組為先加入胸腺嘧啶核苷(工作濃度為0.05 g·mL-1)作用12 h后再加入諾考達唑(工作濃度為0.05 mg·mL-1)繼續維持12 h。

1.5 流式細胞術檢測 收集細胞,0.25%胰酶消化,用10 mL培養基重懸;4℃,1 000 r·min-1離心8 min, 75%乙醇預冷,-20℃過夜;次日轉入流式管中,每管加入PI(工作濃度0.5 mg·mL-1)50 mL和RNase A (工作濃度100 mg·mL-1)10 mL,37℃,避光水浴30 min;室溫避光放置30 min;FACSCalibur流式細胞儀檢測并分析[1]。

1.6 常規透射電子顯微鏡成像 收集處理后的細胞,沿管壁緩慢加入2.5%戊二醛緩沖固定液,2.5%戊二醛緩沖固定液固定2 h,0.1 mmol·L-1磷酸緩沖液清洗2× 20 min,1%鋨酸后固定30～120 min,0.1 mmol·L-1磷酸緩沖液清洗,按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮(2次)各5 min梯度脫水,丙酮與環氧樹脂1∶1混合半浸透2 h,純環氧樹脂包埋劑浸透2 h,包埋,聚合(80℃恒溫箱內)10 h,修塊。超薄切片染色:醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色各10 min;透射電鏡觀察、攝像。

1.7 糖氧化水平的定量檢測 按照QuantiChromTM糖氧化水平定量試劑盒(BioAssay Systems)說明書依次完成后,檢測A630 nm讀數。

1.8 L-氨基酸水平的定量檢測 按照BioVison L-氨基酸定量檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm。

1.9 ATP水平的比色測定 按照BioVison ATP Colorimetric檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm。

1.10 NAD/NADH水平的定量檢測 按照BioAssay EnzyChromTMNAD/NADH檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm[2]。

1.11 免疫印跡分析 收集細胞,每皿100 mm,加入RIPA裂解液100 mL,冰上裂解30 min;4℃, 12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,根據BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測待測蛋白樣品的A490 nm,計算待測蛋白樣品濃度;準備蛋白樣品100 mg,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;230 mA下轉印約2.5 h;室溫下5·TBS-脫脂牛奶振蕩封閉1 h;加入用封閉液稀釋的一抗,4℃孵育過夜;次日加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗,室溫振動孵育2 h;加入顯色液,避光孵育1 min;暗室曝光,顯影定影,膠片晾干后,經掃描儀掃描,Adobe Photoshop軟件轉換格式后,Image J圖形軟件計算灰度值,進行半定量分析。具體步驟參見已經發表的文章[3]。

1.12 統計學方法 相關實驗數據均采用均數±標準差表示,采用SPSS 19.0版統計分析軟件進行單因素方差分析,組間差異采用雙尾t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 諾考達唑可阻斷rVSMCs的增殖狀態 流式細胞術檢測結果顯示,A組大鼠血管平滑肌細胞G0/G1期、S期和G2/M期的細胞分布比例平均值依次為:51.36%, 39.53%和9.12%;B組采用無血清DMEM高糖培養基同步化培養24 h,平均約80.10%細胞停滯于G0/G1期; C組采用無血清DMEM高糖培養基同步化培養48 h,接著換DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)繼續培養18 h,(58.88±4.72)%的rVSMCs停滯于S期;D組直接加入胸腺嘧啶核苷作用12 h將細胞同步化后,再加入諾考達唑繼續作用12 h后,平均75.07%的rVSMCs被阻滯于G2/M期(n=6)。見圖1。

2.2 電子顯微鏡結果顯示諾考達唑處理rVSMCs后超微結構的改變 電子顯微鏡觀察顯示,C組與A組和B組比較,線粒體數量基本不變,但是明顯腫脹甚至透亮;但是,D組諾考達唑處理后,其線粒體的數量明顯減少,體積也顯著縮小,還出現了大量的自噬體。見圖2。

2.3 諾考達唑可導致rVSMCs能量代謝降低 A組與C組、B組與D組的rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝、ATP的產生以及NAD/NADH的代謝水平均差異無統計學意義,但是,D組與A組和C組比較,rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝、ATP的產生均明顯降低,NADH產生顯著增高(P＜0.05或P＜0.01,n=12)。見圖3。

2.4 諾考達唑可上調Mfn-2的表達 免疫印跡半定量分析的結果表明,A、B、C、D組rVSMCs中Mfn-2蛋白條帶與內參Tubulin的相對灰度值分別為(0.331± 0.055),(1.057±0.424),(0.266±0.078),(1.067± 0.425)(n=9)(P＜0.05),即增殖期較未增殖期相比, Mfn-2的表達降低,諾考達唑處理后Mfn-2的表達較增殖期增高。見圖4。

A.A組;B.B組;C.C組;D.D組圖1 4組細胞周期的流式細胞術檢測結果(n=6)A.group A;B.group B;C.group C;D.group DFig.1 Results of cell cycle distribution in four groups by flow cytometry analysis(n=6)

A.A組;B.B組;C.C組;D.D組(粗箭頭示線粒體,細箭頭示自噬體)圖2 4組細胞超微結構的電子顯微鏡結果A.group A;B.group B;C.group C;D.group D(coarse arrows show mitochondria,fine arrows show autophagosome)Fig.2 Ultrastucture changes of four groups of cells by transmission electron microscopy

A.糖代謝的水平;B.氨基酸代謝水平;C.ATP的產生;D.NAD水平;1.A組;2.B組;3.C組;4.D組;與A組比較,*1P＜0.01;與C組比較,*2P＜0.05圖3 諾考達唑處理后rVSMCs能量代謝的變化(n=12)A.metabolic levels of glucose;B.metabolic levels of L-amino acid;C.ATP production;D.NAD level;1.group A;2.group B;3.group C;4.group D;compared with group A,*1P＜0.01;compared with group C,*2P＜0.05Fig.3 Changes of energy metabolism of rVSMCs after nocodazole treatment(n=12)

A.電泳圖;B.柱形圖;1.A組;2.B組;3.C組;4.D組;與A組比較,*1P＜0.05;與C組比較,*2P＜0.05圖4 諾考達唑處理后Mfn-2表達的變化(n=12)A.electrophotogram;B.histogram;1.group A;2.group B;3. group C;4.group D;compared with group A,*1P＜0.05;compared with group C,*2P＜0.05Fig.4 Changes of Mfn-2 expression after nocodazole treatment(n=12)

3 討論

血管平滑肌細胞增殖的分子機制一直是動脈粥樣硬化以及PCI術后再狹窄研究的熱點。目前的研究認為炎癥與免疫、血流動力學的不穩定等在血管平滑肌細胞的增殖中扮演著重要的角色。筆者的研究發現諾考達唑可阻斷大鼠血管平滑肌細胞的增殖狀態并降低其能量代謝,可能與Mfn-2抑制平滑肌細胞增殖的分子機制有關。通過細胞周期的各個階段的啟動和后續進展的精確控制細胞增殖至關重要。胸腺嘧啶核苷與諾考達唑是研究細胞周期中常用的誘導藥物。胸腺嘧啶核苷作為一種常用的DNA合成抑制藥可逆地抑制S期細胞DNA合成而不影響其他細胞周期運轉,將處于不同時相的細胞群體阻斷在G1/S期交界處;諾考達唑是一種紡錘體抑制藥,可抑制紡錘體的形成及功能,最終可將細胞群體阻斷在G2/M期,細胞發生嚴重的核內復制,導致多倍體細胞的形成,失去細胞正常的增殖功能。

通過進一步的研究發現,諾考達唑阻斷rVSMCs的增殖狀態的同時,rVSMCs的線粒體的形態、分布與能量代謝均發生了明顯的變化。這提示諾考達唑阻斷rVSMCs的增殖狀態與線粒體中的某種物質有關。筆者研究發現諾考達唑處理后rVSMCs中Mfn-2的表達較增殖期升高,故而推測諾考達唑阻斷rVSMCs的增殖狀態與Mfn-2有關。Mfn-2是分布于線粒體外膜與線粒體融合與分裂相關的蛋白質。筆者早期的實驗已經證實,抑制Mfn-2的表達會導致rVSMCs的增殖[1],增強Mfn-2的表達可抑制rVSMCs的增殖[4]。實驗顯示增殖期C組的rVSMCs線粒體較A組明顯腫脹,胸腺嘧啶核苷聯合諾考達唑處理后rVSMCs線粒體的體積明顯縮小,數量驟減,并出現大量的自噬體,同時,細胞停滯生長期B組線粒體的體積也比較小,也有一部分自噬體,即諾考達唑處理后細胞的超微結構與B組非常相似。與增殖期相比,諾考達唑處理后rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝水平明顯降低,ATP的產生銳減, NADH的水平明顯增多而NAD的水平明顯降低。這可能是由于糖代謝、氨基酸代謝均檢測的是胞質中的代謝水平,諾考達唑處理后rVSMCs發生嚴重的核內復制,其糖代謝主要依賴糖酵解,代謝水平遠遠低于糖氧化,故ATP的生成明顯減少,三羧酸循環的限速酶NADH的產生也顯著減少;其氨基酸代謝的來源主要為核內氨基酸,代謝水平也降低。而且諾考達唑處理后rVSMCs代謝水平與B組差異無統計學意義,B組與諾考達唑處理后rVSMCs中Mfn-2的表達均比C組增高。提示諾考達唑可能通過誘導rVSMCs中Mfn-2的表達來阻斷rVSMCs的增殖狀態。在線粒體內Mfn-2在鈣離子介導的NADH的產生中起著關鍵的作用[5-6],Mfn-2可介導內質網與線粒體的融合[7-8],導致線粒體從內質網攝取鈣離子促進葡萄糖氧化,三羧酸循環限速酶NADH的產生增加。

總之,諾考達唑可阻斷rVSMCs的增殖狀態,導致rVSMCs的線粒體的體積縮小、數量減少,能量代謝降低,可能與Mfn-2有關,相關的分子機制還有待于進一步的研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.007

Effect and Underlying Mechanism of Nocodazole on Inhibition of Rat Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation

LI Dan,GUO Xiao-mei
(Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the effect and underlying mechanism of nocodazole on the inhibition of rVSMCs proliferation.MethodsrVSMCs were divided into four groups,group A(normal culture),group B(serum-free culture for 24 h),group C(18 h normal culture after 48 h of serum-free culture),and group D(nocodazole treatment for 12 h after thymidine treatment for 12 h).Flow cytometry,transmission electron microscopy,and metabolism measurements were performed and mitofusin-2(Mfn-2)expression was detected.ResultsFlow cytometry analysis showed rVSMCs of group B、C、D were arrested to G0/G1,S and G2/M phases,respectively.Less and smaller mitochondria were observed in group D by transmission electron microscopy in nocodazole-treated rVSMCs.Compared with groups A and C,there were significant decreases in glucose and L-amino acid metabolism,levels of ATP,and marked increase in NADH in group D(P＜0.05).Western Blot showed that G2/M cell cycle arrest and nocodazole could induce up-regulation of Mfn-2 in rVSMCs(P＜0.05).ConclusionNocodazole can block the energy metabolism and proliferation in rVSMCs,which is probably associated with the role of Mfn-2 on antiatherosclerosis.

Nocodazole;Proliferation,vascular smooth muscle cells;Rat;Metabolism,energy;Mitofusin-2,energy; Atherosclerosis

R972.6;R965

A

1004-0781(2014)08-1004-05

2014-01-02

2014-03-08

*國家自然科學基金資助項目(30872714)

李丹(1980-),女,湖北鄂州人,在讀博士,研究方向:分子心臟病學。電話:027-83663608,E-mail:tjhlidan@126.com。

郭小梅(1959-),男,湖北大冶人,主任醫師,教授,博士,研究方向:分子心臟病學。電話:027-83663608,E-mail:xmguo @tjh.tjmu.edu.cn。