高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚的含量*

劉歡,陳劍鋒,王靜,袁子民

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),大連 116600;2.遼寧成大方圓醫(yī)藥有限公司,沈陽(yáng) 110005)

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚的含量*

劉歡1,陳劍鋒2,王靜1,袁子民1

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),大連 116600;2.遼寧成大方圓醫(yī)藥有限公司,沈陽(yáng) 110005)

目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量測(cè)定方法。方法色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm,柱溫25℃,流速1.0 mL·min-1。結(jié)果肉豆蔻木脂素在10.24～61.44 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.999 6,平均回收率為97.94% (n=6),RSD為2.01%。去氫二異丁香酚在3.0～18.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.999 8,平均回收率為97.11% (n=6),RSD為2.17%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于同時(shí)測(cè)定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚丁香酚的含量。

肉豆蔻;肉豆蔻木脂素;去氫二異丁香酚;色譜法,高效液相

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟種仁,具有溫中行氣,澀腸止瀉功效[1]。肉豆蔻的主要成分為揮發(fā)油、木脂素、脂肪油等。肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚是肉豆蔻中非揮發(fā)性成分,其中肉豆蔻木脂素具有抗氧化及肝保護(hù)作用,對(duì)肝臟藥物代謝酶活性有一定程度的抑制作用,能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和心血管平滑肌收縮[2-3],去氫二異丁香酚有較強(qiáng)的抑菌作用[3-4]。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版中規(guī)定高效液相色譜法測(cè)定肉豆蔻藥材中的去氫二異丁香酚的含量作為質(zhì)量控制依據(jù),亦有研究報(bào)道采用高效液相法測(cè)定肉豆蔻衣中的去氫二異丁香酚的含量作為其質(zhì)量控制依據(jù)[5],而對(duì)肉豆蔻木脂素的含量測(cè)定較少。因此筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、切片后麩煨肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,考察麩煨前后含量變化,為肉豆蔻、麩煨肉豆蔻炮制機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Sartorius CP225D十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó));SG3300型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);電子分析天平(SHIMADZU CORPORATION);Agilent 1100高效液相色譜儀(chemistation system工作站);Agilent 1100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;Aglient 1100系列泵系統(tǒng);日普利PRL-D2000柱溫箱。

1.2 試藥 肉豆蔻(浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠提供,產(chǎn)地:印度尼西亞,批號(hào):090414),經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)賈天柱教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟種仁;麩煨肉豆蔻(按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版方法炮制)、麩煨肉豆蔻片(肉豆蔻切成厚片后麩煨)自制。去氫二異丁香酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):11838-201102);肉豆蔻木脂素對(duì)照品(上海時(shí)代生物科技有限公司,批號(hào):12051001);甲醇為色譜純,乙醇為分析純,水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為水;梯度洗脫程序:0～5 min,A:60%～62.5%,B:40%～37.5%;～10 min,A:62.5%～65%,B:37.5%～35%;～25 min,A:65%～70%,B:35%～30%;～35 min,A:70%～78%,B:30%～22%;～45 min,A: 78%～80%,B:22%～20%;～50 min,A:80%～90%,B:20%～10%。流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對(duì)照品適量,精密稱定,分別置于100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別制成含肉豆蔻木脂素204.8 μg·mL-1、含去氫二異丁香酚60.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片粉末(過(guò)篩孔內(nèi)徑0.85 mm篩)0.25 g,精密稱定,分別置具塞錐形瓶中,精密加入80%乙醇25 mL,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率30 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對(duì)照品溶液各25 mL,置50 mL量瓶中,混勻。精密量取混合對(duì)照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0, 5.0,6.0 mL分別置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得不同濃度的系列對(duì)照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣10 μL,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程分別為:肉豆蔻木脂素Y=4.391X+1.571(r=0.999 6),去氫二異丁香酚Y=64.493X+5.447(r=0.999 8)。其結(jié)果表明,肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚分別在10.24～61.44,3.0～18.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一肉豆蔻供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的RSD分別為1.75%,1.68%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一肉豆蔻粉末,過(guò)篩孔內(nèi)徑0.850 mm(20目)篩,按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液,測(cè)定肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量。其平均含量分別為2.357 0,1.134 1 mg·g-1, RSD分別為2.41%,1.81%。表明該法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一肉豆蔻供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,分別在0,2,4,6,8 h進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,計(jì)算肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的RSD分別為2.17%,2.07%。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一肉豆蔻粉末(已知肉豆蔻木脂素含量為0.239 6%,去氫二異丁香酚含量為0.109 0%)0.125 g各6份,分別精密加入肉豆蔻木脂素對(duì)照品溶液(濃度為204.8 μg·mL-1) 1.5 mL、去氫二異丁香酚對(duì)照品溶液(濃度為60.0 μg·mL-1)2.5 mL,再精密加入80%乙醇21.5 mL,其余按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)色譜條件下操作,測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。肉豆蔻木脂素平均回收率97.94%,RSD=2.01%;去氫二異丁香酚平均回收率97.11%,RSD=2.17%。

2.9 樣品含量測(cè)定 分別取肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片粉末,按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液,在同一色譜條件下測(cè)定肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表2,色譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

將肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對(duì)照品溶液分別在200～400 nm進(jìn)行掃描,肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚在220,270 nm處均有強(qiáng)吸收,綜合考慮分離度及溶劑影響,選擇270 nm作為紫外測(cè)定波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)曾考察過(guò)提取溶劑(甲醇、80%乙醇)和提取時(shí)間(10, 20,30 min)對(duì)肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量影響,結(jié)果表明80%乙醇超聲30 min,對(duì)肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的提取效果較好。本方法簡(jiǎn)單且重復(fù)性較好。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片作含量測(cè)定,結(jié)果麩煨后肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量均降低,其中麩煨對(duì)肉豆蔻木脂含量影響較小,對(duì)去氫二異丁香酚含量影響較大。

表1 肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recoveryresultsofnutmeglignanand dehydrodiisoeugenol

表2 肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol %,n=3

1.肉豆蔻木脂素;2.去氫二異丁香酚圖1 對(duì)照品(A)、肉豆蔻(B)、麩煨肉豆蔻(C)和麩煨肉豆蔻片(D)高效液相色譜圖1.nutmeg lignan;2.dehydrodiisoeugenolFig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)、nutmeg(B)、nutmeg roasted with wheat bran(C)and sliced nutmeg roasted with wheat bran(D)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:212.

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.025

Determination of Content of Nutmeg Lignan and Dehydrodiisoeugenol in Nutmeg by HPLC

LIU Huan1,CHEN Jian-feng2,WANG Jing1,YUAN Zi-min1
(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China;2.Liaoning Chengda Fangyuan Medicine Chained Limited Company, Shenyang 110005,China)

Objective To develope a high performance liquid chromatograph(HPLC)method for simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after processing of nutmeg.MethodsThe column was Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was methanol-water in a gradient elution mode.The UV detection wave length was 274 nm.The column temperature was 25℃.The flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsNutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol had a good linear correlation in ranges of 10.24-61.44 μg·mL-1(r=0.999 6)and 3.0-18.0 μg·mL-1(r=0.999 8),respectively.The average recovery rates were 97.94%(RSD=2.17%)and 97.11%(RSD=2.17%).Conclusion The method is simple,accurate,reproducible,and can be used for the simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after the processing of nutmeg.

Nutmeg;Nutmeg lignan;Dehydrodiisoeugenol;Chromatograph,high performance liquid

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1070-03

2013-10-24

2013-12-31

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81274084)

劉歡(1989-),女,遼寧朝陽(yáng)人,在讀碩士,研究方向:藥物分析。電話:(0)15842696224,E-mail:liuhuan.cat@ 163.com。

袁子民(1975-),男,遼寧朝陽(yáng)人,副教授,博士,研究方向:新藥研究與開(kāi)發(fā)及中藥炮制機(jī)制研究。電話: 0411-85890145,E-mail:yuanzmin@163.com。