高效液相色譜法同時測定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚的含量*

劉歡,陳劍鋒,王靜,袁子民

(1.遼寧中醫藥大學,大連 116600;2.遼寧成大方圓醫藥有限公司,沈陽 110005)

高效液相色譜法同時測定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚的含量*

劉歡1,陳劍鋒2,王靜1,袁子民1

(1.遼寧中醫藥大學,大連 116600;2.遼寧成大方圓醫藥有限公司,沈陽 110005)

目的 建立高效液相色譜法同時測定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量測定方法。方法色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-水梯度洗脫,檢測波長270 nm,柱溫25℃,流速1.0 mL·min-1。結果肉豆蔻木脂素在10.24～61.44 μg·mL-1范圍內線性關系良好,r=0.999 6,平均回收率為97.94% (n=6),RSD為2.01%。去氫二異丁香酚在3.0～18.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好,r=0.999 8,平均回收率為97.11% (n=6),RSD為2.17%。結論該方法簡單、準確、重復性好,可用于同時測定肉豆蔻麩煨前后肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚丁香酚的含量。

肉豆蔻;肉豆蔻木脂素;去氫二異丁香酚;色譜法,高效液相

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟種仁,具有溫中行氣,澀腸止瀉功效[1]。肉豆蔻的主要成分為揮發油、木脂素、脂肪油等。肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚是肉豆蔻中非揮發性成分,其中肉豆蔻木脂素具有抗氧化及肝保護作用,對肝臟藥物代謝酶活性有一定程度的抑制作用,能夠抑制腫瘤細胞生長和心血管平滑肌收縮[2-3],去氫二異丁香酚有較強的抑菌作用[3-4]?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版中規定高效液相色譜法測定肉豆蔻藥材中的去氫二異丁香酚的含量作為質量控制依據,亦有研究報道采用高效液相法測定肉豆蔻衣中的去氫二異丁香酚的含量作為其質量控制依據[5],而對肉豆蔻木脂素的含量測定較少。因此筆者在本實驗中對肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、切片后麩煨肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量同時進行測定,考察麩煨前后含量變化,為肉豆蔻、麩煨肉豆蔻炮制機制的深入研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Sartorius CP225D十萬分之一分析天平(德國);SG3300型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);電子分析天平(SHIMADZU CORPORATION);Agilent 1100高效液相色譜儀(chemistation system工作站);Agilent 1100可變波長檢測器;Aglient 1100系列泵系統;日普利PRL-D2000柱溫箱。

1.2 試藥 肉豆蔻(浙江中醫藥大學飲片廠提供,產地:印度尼西亞,批號:090414),經遼寧中醫藥大學賈天柱教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟種仁;麩煨肉豆蔻(按《中華人民共和國藥典》2010年版方法炮制)、麩煨肉豆蔻片(肉豆蔻切成厚片后麩煨)自制。去氫二異丁香酚對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:11838-201102);肉豆蔻木脂素對照品(上海時代生物科技有限公司,批號:12051001);甲醇為色譜純,乙醇為分析純,水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)。流動相:A相為甲醇,B相為水;梯度洗脫程序:0～5 min,A:60%～62.5%,B:40%～37.5%;～10 min,A:62.5%～65%,B:37.5%～35%;～25 min,A:65%～70%,B:35%～30%;～35 min,A:70%～78%,B:30%～22%;～45 min,A: 78%～80%,B:22%～20%;～50 min,A:80%～90%,B:20%～10%。流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:270 nm;柱溫:25℃;進樣量:10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 取肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對照品適量,精密稱定,分別置于100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別制成含肉豆蔻木脂素204.8 μg·mL-1、含去氫二異丁香酚60.0 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片粉末(過篩孔內徑0.85 mm篩)0.25 g,精密稱定,分別置具塞錐形瓶中,精密加入80%乙醇25 mL,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率30 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質量,用80%乙醇補足減失的質量,搖勻,用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過,取續濾液,即得。

2.4 線性關系考察 分別精密量取肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對照品溶液各25 mL,置50 mL量瓶中,混勻。精密量取混合對照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0, 5.0,6.0 mL分別置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得不同濃度的系列對照品溶液。按照“2.1”項色譜條件依次進樣10 μL,以對照品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得到回歸方程分別為:肉豆蔻木脂素Y=4.391X+1.571(r=0.999 6),去氫二異丁香酚Y=64.493X+5.447(r=0.999 8)。其結果表明,肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚分別在10.24～61.44,3.0～18.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗 取同一肉豆蔻供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下,連續進樣6次,記錄峰面積,計算肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的RSD分別為1.75%,1.68%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗 取同一肉豆蔻粉末,過篩孔內徑0.850 mm(20目)篩,按“2.3”項下方法分別制備6份供試品溶液,測定肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量。其平均含量分別為2.357 0,1.134 1 mg·g-1, RSD分別為2.41%,1.81%。表明該法重復性良好。

2.7 穩定性實驗 取同一肉豆蔻供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下,分別在0,2,4,6,8 h進樣10 μL,記錄峰面積,計算肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的RSD分別為2.17%,2.07%。表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取同一肉豆蔻粉末(已知肉豆蔻木脂素含量為0.239 6%,去氫二異丁香酚含量為0.109 0%)0.125 g各6份,分別精密加入肉豆蔻木脂素對照品溶液(濃度為204.8 μg·mL-1) 1.5 mL、去氫二異丁香酚對照品溶液(濃度為60.0 μg·mL-1)2.5 mL,再精密加入80%乙醇21.5 mL,其余按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液。按照“2.1”項色譜條件下操作,測定,結果見表1。肉豆蔻木脂素平均回收率97.94%,RSD=2.01%;去氫二異丁香酚平均回收率97.11%,RSD=2.17%。

2.9 樣品含量測定 分別取肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片粉末,按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液,在同一色譜條件下測定肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量。結果見表2,色譜圖見圖1。

3 討論

將肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對照品溶液分別在200～400 nm進行掃描,肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚在220,270 nm處均有強吸收,綜合考慮分離度及溶劑影響,選擇270 nm作為紫外測定波長。本實驗曾考察過提取溶劑(甲醇、80%乙醇)和提取時間(10, 20,30 min)對肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含量影響,結果表明80%乙醇超聲30 min,對肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的提取效果較好。本方法簡單且重復性較好。本實驗分別對肉豆蔻、麩煨肉豆蔻、麩煨肉豆蔻片作含量測定,結果麩煨后肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量均降低,其中麩煨對肉豆蔻木脂含量影響較小,對去氫二異丁香酚含量影響較大。

表1 肉豆蔻木脂素和去氫二異丁香酚加樣回收率實驗結果Tab.1 Recoveryresultsofnutmeglignanand dehydrodiisoeugenol

表2 肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含量測定結果Tab.2 Results of content determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol %,n=3

1.肉豆蔻木脂素;2.去氫二異丁香酚圖1 對照品(A)、肉豆蔻(B)、麩煨肉豆蔻(C)和麩煨肉豆蔻片(D)高效液相色譜圖1.nutmeg lignan;2.dehydrodiisoeugenolFig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)、nutmeg(B)、nutmeg roasted with wheat bran(C)and sliced nutmeg roasted with wheat bran(D)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:212.

[2] SOHN J H,HAN K L,KIM J H,et al.Protective effects of macelignan on cisplatin-induced hepatotoxicity is associated with JNK activation[J].Biol Pharm Bull,2008,31(2): 273-277.

[3] 李飛,楊秀偉,程燕,等.肉豆蔻木脂素的體外代謝初步研究[J].中國新藥雜志,2008,17(7):560-564.

[4] 袁子民,賈天柱,張艷秋,等.商品肉豆蔻藥材的指紋圖譜研究[J].中國中醫藥信息雜志,2008,15(9):41-42.

[5] 王航宇,王書云,李國玉,等.高效液相色譜法測定肉豆蔻衣中去氫二異丁香酚含量[J].醫藥導報,2013,32(5): 647-649.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.025

Determination of Content of Nutmeg Lignan and Dehydrodiisoeugenol in Nutmeg by HPLC

LIU Huan1,CHEN Jian-feng2,WANG Jing1,YUAN Zi-min1
(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China;2.Liaoning Chengda Fangyuan Medicine Chained Limited Company, Shenyang 110005,China)

Objective To develope a high performance liquid chromatograph(HPLC)method for simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after processing of nutmeg.MethodsThe column was Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was methanol-water in a gradient elution mode.The UV detection wave length was 274 nm.The column temperature was 25℃.The flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsNutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol had a good linear correlation in ranges of 10.24-61.44 μg·mL-1(r=0.999 6)and 3.0-18.0 μg·mL-1(r=0.999 8),respectively.The average recovery rates were 97.94%(RSD=2.17%)and 97.11%(RSD=2.17%).Conclusion The method is simple,accurate,reproducible,and can be used for the simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after the processing of nutmeg.

Nutmeg;Nutmeg lignan;Dehydrodiisoeugenol;Chromatograph,high performance liquid

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1070-03

2013-10-24

2013-12-31

*國家自然科學基金資助項目(81274084)

劉歡(1989-),女,遼寧朝陽人,在讀碩士,研究方向:藥物分析。電話:(0)15842696224,E-mail:liuhuan.cat@ 163.com。

袁子民(1975-),男,遼寧朝陽人,副教授,博士,研究方向:新藥研究與開發及中藥炮制機制研究。電話: 0411-85890145,E-mail:yuanzmin@163.com。