香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜研究*

張辰辰，楊繼章，吳丹，劉紅淼

(河北醫科大學第一醫院藥劑科，石家莊 050031)

香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜研究*

張辰辰，楊繼章，吳丹，劉紅淼

(河北醫科大學第一醫院藥劑科，石家莊 050031)

目的 建立香桂化濁膠囊高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器(HPLC-PDA)指紋圖譜的分析方法,完善香桂化濁膠囊的質量控制標準。方法以高效液相色譜法為基礎,采用DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,流動相為甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液,梯度洗脫,流速1.0mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長280 nm。結果相同色譜條件下,8批香桂化濁膠囊的相似度均>0.9,藥物組成一致性較好。結論該方法操作簡便、準確,可作為香桂化濁膠囊的鑒別和質量控制。

香桂化濁膠囊；指紋圖譜；桂皮醛；廣藿香酮；大黃素

香桂化濁膠囊處方為河北醫科大學第一醫院臨床應用多年的經驗方,由肉桂、土大黃、廣藿香組成。具有芳香醒脾、清化濕濁之功,其療效確切。主治因各種疾病后邪留未盡、脾胃內傷所致長期大便溏泄或有黏液、腹脹腸鳴、納呆或有低熱、舌苔白膩或白滑或見微黃、脈濡緩；主要用于慢性腸炎、真菌感染致腸炎證屬脾虛濕困的治療。關于本方制劑工藝、質量控制、含量測定及毒理學研究的方法已有報道［1-6］。鑒于香桂化濁膠囊在化學組成上是一個復雜體系,各成分構成不明確,有效成分和雜質沒有明確的劃分,化學成分間共存的相互作用不明確,而中藥指紋圖譜能夠部分反映中藥中所含化學成分的組成、數量及其適當的比例關系［7］。為更好地控制香桂化濁膠囊的質量,完善其檢測標準,筆者采用高效液相色譜(HPLC)法,建立了香桂化濁膠囊的指紋圖譜。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、在線脫氣機、光電二極管陣列(photo-diode-array, PDA)檢測器、數據處理工作站(日本島津公司)；BS210S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗儀(頻率:40 kHz,功率: 100W,昆山市超聲儀器有限公司)；《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)》(國家藥典委員會)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(色譜純,美國TEDIA公司),水為娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純。大黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110756-200110)；廣藿香酮對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111822-201001)；桂皮醛對照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號:101114,純度:HPLC≥98%)；香桂化濁膠囊(河北醫科大學第一醫院制劑室,批號:120208,120222,120229,120314,120328, 120404,120411,120425)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取肉桂醛、廣藿香酮、大黃素對照品適量,分別置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻。分別取肉桂醛、廣藿香酮和大黃素對照品各1 mL至10 m L量瓶中,用甲醇稀釋定容成濃度分別為200.00,15.87,85.16μg·m L-1的混合溶液,即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取香桂化濁膠囊0.74 g,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,精密稱重,浸泡2 h后超聲處理30 min,冷卻后用甲醇補足失重,搖勻,經孔徑0.45μm微孔濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.3 色譜條件和系統適用性實驗 色譜柱: DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動相:甲醇-乙腈-0.1%醋酸溶液,梯度洗脫,以甲醇為流動相A,乙腈為流動相B,0.1%醋酸溶液為流動相C,洗脫程序見表1；檢測波長:280 nm；柱溫:30℃；進樣量: 20μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 參照物肉桂醛的確定 將上述已配制好的肉桂醛、廣藿香酮和大黃素對照品混合溶液和供試品溶液按“2.3”項下的分離條件進行測定,得圖1。根據單一對照品保留時間及相應對照品紫外光譜得知圖1中1號峰為肉桂醛峰,2號峰為廣藿香酮峰,3號峰為大黃素峰。肉桂醛峰與相鄰峰分離度良好,保留時間適中,故選作參照峰(S),確定18個共有峰。計算各樣品中非共有峰占總峰面積的比值,結果表明其值均<5%。90 min樣品供試品溶液色譜圖表明,組分在65 min內出峰完全。

2.5 方法學考察

2.5.1 穩定性實驗 精密量取批號為120208的香桂化濁膠囊供試品溶液,按上述色譜條件分別在0,2,4, 8,12,24,48 h進樣測定,記錄各共有峰保留時間和面積,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結果表明各共有峰的相對保留時間的RSD=0.28%～0.97%,相對峰面積的RSD 0.76%～2.33%,表明供試品溶液在48 h內穩定。

圖1 兩種溶液的HPLC色譜圖A.對照品;B.供試品;1.肉桂醛;2.廣藿香酮;3.大黃素Fig.1 HPLC chromatogram of two kinds of solutionsA.reference;B.test;1.cinanamic aldehyde reference; 2.patchouli ketone reference;3.emodin reference

2.5.2 精密度實驗 精密稱取批號為120208的香桂化濁膠囊供試品溶液適量,按上述色譜條件連續進樣5次,記錄各共有峰保留時間和面積,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結果表明各共有峰的相對保留時間的RSD 0.16%～0.84%,相對峰面積的RSD 0.48%～2.01%,表明本實驗所用儀器的精密度良好。

2.5.3 重復性實驗 精密稱取批號為120208的香桂化濁膠囊適量,制備供試品溶液5份,按上述色譜條件分別進樣測定,記錄各共有峰保留時間和面積,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結果表明,各共有峰的相對保留時間的RSD 0.39%～0.47%,相對峰面積的RSD 0.89%～2.58%,表明本實驗重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立及分析

2.6.1 指紋圖譜的建立 取8批香桂化濁膠囊,按“2.2”項下的方法制備供試品溶液,按“2.3”項下的色譜條件進樣檢測進行測定,得到8批樣品的指紋圖譜。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”得到其疊加圖,見圖2。

2.6.2 共有指紋峰的標定及計算 根據8批供試品溶液的測定結果,分析確定了香桂化濁膠囊的18個共有指紋峰,以肉桂醛為參考峰,將其相對保留時間和相對峰面積定為1,計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD,得到各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<2%,結果見表2,3。

圖2 8批樣品和對照品的HPLC指紋圖譜S1～8.第1～8批樣品;R.對照品;1.肉桂醛;2.廣藿香酮; 3.大黃素Fig.2 HPLC fingerprints of 8 batches of samples and referenceS1-8.first to eighth batches of samp les;R.reference; 1.cinanam ic aldehyde;2.patchouli ketone;3.emodin

2.6.3 香桂化濁膠囊指紋圖譜相似度測定 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)》評價8批香桂化濁膠囊的指紋圖譜,以均值法生成對照指紋圖譜,建立共有模式,測得各批次樣品與共有模式間的相似度,結果均在0.9以上,說明工藝較穩定,結果見表4。

3 討論

筆者主要是建立香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜特征,并對不同批次的香桂化濁膠囊進行比較,為有效控制香桂化濁膠囊的質量提供了新方法。為了得到滿意的分離效果,實驗比較了水、甲醇、乙醇(分別為25%,50%,75%,100%)對提取率(超聲和回流)的影響。結果顯示,純甲醇的提取率最高,超聲效果優于回流,所以確定提取方法為純甲醇超聲提取。對于流動相的選擇,筆者嘗試了甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液以及甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液。結果發現,甲醇-0.1%冰醋酸溶液的色譜峰分離度小,不符合高效液相色譜法的要求；乙腈-0.1%冰醋酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動相的分離結果相似。故選擇甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動相。關于檢測波長的選擇,本實驗比較了香桂化濁膠囊在254,280和310 nm波長下的圖譜。結果顯示,在280 nm的波長下,色譜基線平穩,噪聲干擾最小,各色譜峰吸收度適中,出峰均勻,圖譜信息完整,因此選擇280 nm作為檢測波長。

通過相似度計算,發現8批樣品具有相同的色譜特征峰,且各峰的保留時間穩定,相似度較高,表明該實驗所建立的方法穩定性好,具有可操作性。本方法操作簡便、準確,可作為香桂化濁膠囊的鑒別和質量控制。

表2 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule min

表3 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜共有峰的相對峰面積Tab.3 Relative peak area of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xiangguihuazhuo capsule

表4 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜相似度數據Tab.4 Sim ilarity of HPLC fingerp rints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule

［1］劉紅淼,姜少灝,張振杰,等.正交實驗優選香桂化濁膠囊中揮發油的包合工藝[J].中國藥房,2010,21(47):4449-4450.

［2］劉紅淼,房桂珍,李艷玲,等.香桂化濁膠囊成型工藝研究[J].中國藥房,2011,22(11):990-991.

［3］劉紅淼,楊繼章,王云志,等.香桂化濁膠囊質量標準研究[J].中國藥房,2011,22(27):2553-2554.

［4］楊繼章,劉紅淼,李艷玲.肉桂油的研究進展[J].中國藥房,2011,22(27):2579-2581.

［5］劉紅淼,楊繼章,李艷玲.HPLC法測定香桂化濁膠囊中大黃素的含量[J].中國藥房,2012,23(15):1397-1398.

［6］劉紅淼,李艷玲,楊繼章,等.香桂化濁膠囊毒理學研究[J].醫藥導報,2013,32(2):17-21.

［7］李家春,孫蘭,李紅娟,等.桂枝茯苓膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2012,43(7):1333-1335.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.025

Study on HPLC-PDA Fingerprints of Xianggui Huazhuo Capsule

ZHANG Chen-chen,YANG Ji-zhang,WU Dan,LIU Hong-miao
(Department of Pharmacy,the First Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050031,China)

Objective To establish a HPLC-PDA fingerprint analysis for theχianggui huazhuocapsule,and improve the quality control standard for it. ，MethodsHPLC separation was carried out on DiamonsilTMC18column(250 mm× 4.6mm,5μm).Themobile phase was composed ofmethanol,acetonitrile and 0.1%glacial acetic acid with gradient elution. The flow rate wasmaintained at 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30℃.The detective wavelength was 280 nm.ResultsUnder the same chromatographic conditions,the similarity of eight batches ofχianggui huazhuocapsule was above0.9,and the chemical composition was consistent among different batches.ConclusionThe operation is simple and accurate,and therefore can be used for the identification and quality control ofχianggui huazhuocapsule.

Xianggui huazhuocapsule;Fingerprint;Cinanamic aldehyde;Patchouli ketone;Emodin

R284;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0086-04

2013-01-09

2013-05-22

*河北省中醫藥管理局科研計劃課題資助項目(2012083)

張辰辰(1987-),女,河北石家莊人,在讀碩士,研究方向:藥劑學。電話：(0)15333315270,E-mail：zhangchenchen6666@163.com。

楊繼章(1957-),男,河北邢臺人,主任藥師,教授,碩士生導師,研究方向:藥物新劑型、藥物穩定性。電話： 0311-85917352,E-mail：yjzh1957@163.com。