高效液相色譜切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛蒡子中活性成分的含量*

孫艷濤，趙蘭英，李婷婷，趙磊，姜大雨

(1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四平 136000；2.吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四平 136000；3.吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，四平 136000)

高效液相色譜切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛蒡子中活性成分的含量*

孫艷濤1，2，趙蘭英1，李婷婷1，趙磊3，姜大雨1，2

(1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四平 136000；2.吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四平 136000；3.吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，四平 136000)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛蒡子中3種活性成分含量。方法應(yīng)用TC-C18色譜柱(4.6 mm×250mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇-0.4%冰醋酸,梯度洗脫;流速1.0 mL·m in-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為280與326 nm切換;進(jìn)樣量10μL;溫度25℃。結(jié)果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元分別在0.027 3～5.460 0,0.150 0～18.000 0和0.030 3～6.060 0μg范圍內(nèi)呈良好線性,線性方程分別為Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391和Y= 287.661X+4.045;平均加樣回收率分別為99.55%,99.42%和99.40%。結(jié)論該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于牛蒡子中多組分含量的同時(shí)測(cè)定及質(zhì)量控制。

牛蒡子；綠原酸；牛蒡子苷；牛蒡子苷元

牛蒡子來(lái)源于菊科兩年生草本植物牛蒡子屬牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果實(shí)［1］,為常用中藥,有疏風(fēng)散熱、解毒透疹、利咽消腫等功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明牛蒡子有抗病毒、抗炎、抗癌、抑制熱休克反應(yīng)等廣泛的藥理活性［2］。為建立高效液相色譜(HPLC)切換波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定牛蒡子中3種活性成分含量,筆者首次利用切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛蒡子提取物中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的含量,可為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；GWA-UN4系列超純水器(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA1104N萬(wàn)分之一分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SK5200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)儀器有限公司)。

1.2 試藥 牛蒡子苷對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司,批號(hào):12042835,含量:98.0%)；牛蒡子苷元對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司,批號(hào):12050336,含量:97.0%)；綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110753-200413,含量:96.6%)；牛蒡子藥材［來(lái)源:吉林省公主嶺市,經(jīng)吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定為菊科植物牛蒡子屬牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果實(shí)］；甲醇為色譜純；冰醋酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元對(duì)照品,置10 mL量瓶中,加入適量甲醇溶解,并稀釋至刻度,即得濃度為273,1 500和303μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液［3］。

2.2 供試品溶液的配制 按照《中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部》第66頁(yè)中對(duì)于牛蒡子中牛蒡苷含量的測(cè)定方法進(jìn)行樣品的處理:牛蒡子粉末(過(guò)孔徑0.300 mm藥篩)0.5 g,精密稱定,置于50 mL量瓶中；加甲醇約45 mL,超聲處理20 min,加甲醇稀釋刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得［4］。

2.3 色譜條件 色譜柱:TC-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流動(dòng)相:A為甲醇,B為0.4%冰醋酸,梯度洗脫(0～25 min:40%～70%A；25～35 min:70%～40% A；35～40 min:40%～40%A)；流速:1.0 m L·min-1；檢測(cè)器:VWD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng):0～3 min,280 nm；3～6 min,326 nm；6～40 min,280 nm；柱溫:25℃；進(jìn)樣量:10μL。

2.4 色譜圖 按照”2.3”項(xiàng)色譜條件分別取一定濃度綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元混合液和供試品溶液進(jìn)樣。見(jiàn)圖1,2。

圖1 混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖1.綠原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.1 HPLC chromatogram of the m ixed reference solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取“2.1”項(xiàng)條件下配制的對(duì)照品混合溶液,以0.1,0.5,1.0,3.0,5.0,7.0, 9.0和12.0μL為進(jìn)樣量進(jìn)樣,按照“2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種活性成分的量均與峰面積呈良好的線性關(guān)系［5］,結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖1.綠原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.2 HPLC chromatogram of the test solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

表1 3種活性成分的線性關(guān)系方程Tab.1 Linear equation of 3 kinds of active ingredients

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取按照“2.2”項(xiàng)條件配制的一份樣品溶液,連續(xù)進(jìn)樣五次進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)峰面積計(jì)算［6］。結(jié)果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分別為0.4%,0.2%和0.4%,表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取藥材0.5 g,精密稱定,按“2.2”項(xiàng)下方法制備［6］,按上述色譜條件每隔4 h進(jìn)行測(cè)定,共計(jì)進(jìn)樣6次,測(cè)定其穩(wěn)定性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元峰面積(A)的RSD分別為1.1%, 0.8%,1.3%,表明藥材溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)條件配制平行樣品溶液5份,進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分別為0.4%,0.2%和0.3%,表明方法重復(fù)性良好［7］。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取牛蒡子藥材粉末約0.1 g,共6份,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,分別加入含綠原酸0.270 mg·mL-1,牛蒡子苷5.000mg·mL-1,牛蒡子苷元0.420 mg·mL-1的混合溶液(0.1,0.1,0.2,0.2, 0.3,0.3 mL),按照“2.2”項(xiàng)條件配制成樣品溶液,進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算回收率。綠原酸的回收率為99.55%,牛蒡子苷的回收率為99.40%,牛蒡子苷元的回收率為99.42%,RSD均為0.3%。見(jiàn)表2。結(jié)果表明該方法具有良好的回收率。

2.10 樣品含量測(cè)定 按照“2.2”項(xiàng)條件配制平行樣品溶液5份,進(jìn)行測(cè)含量測(cè)定。結(jié)果牛蒡子藥材中綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的平均含量分別為0.203,6.241和0.409 mg·g-1。

表2 3種活性成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery results of 3 kinds of active ingred ients

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 利用紫外分光光度計(jì)對(duì)綠原酸、牛蒡苷和苷元進(jìn)行光度掃描,發(fā)現(xiàn)綠原酸在326 nm處有最大紫外吸收,而牛蒡子苷和牛蒡子苷元在280 nm處有最大紫外吸收,故含量測(cè)定時(shí)分別采用最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選用甲醇∶水；甲醇∶0.1%冰醋酸；甲醇∶0.4%冰醋酸；作為實(shí)驗(yàn)條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在初始比例為甲醇∶0.4%冰醋酸(40∶60)時(shí),進(jìn)行梯度洗脫的時(shí)候,岀峰能夠很好地分離,峰形很好,縮短分析時(shí)間。

［1］王潞,趙烽,劉珂.牛蒡子苷元誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(5):542-547.

［2］蔣淑敏.牛蒡化學(xué)成分和藥理作用的研究現(xiàn)狀[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2001,12(10):941-942.

［3］劉世名,董國(guó)霞,陳靠山.牛蒡葉中綠原酸的提取工藝優(yōu)化[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2003,38(9):659-661.

［4］劉世名,陳靠山.牛蒡葉中微量木脂體牛蒡子苷和牛蒡子苷元的分離與鑒定[J].色譜,2003,21(1):52-55.

［5］郝林華,陳靠山,李光友.耐鹽植物牛蒡的研究進(jìn)展與應(yīng)用[J].海洋科學(xué),2004,28(5):69-72.

［6］米靖宇,汪志超,宋純清.高效液相色譜法測(cè)定不同采購(gòu)地牛蒡子中牛蒡子苷和苷元的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2004,15(11):737-739.

［7］雷海民,畢葳,李強(qiáng),等.不同產(chǎn)地牛蒡子藥材RP-HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材,2006,29(11):1166-1168.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.029

Determination of Effective Constituents in Fructus Arctii by Wavelength Switching Method of HPLC

SUN Yan-tao1,2,ZHAO Lan-ying1,LI Ting-ting1,ZHAO Lei3,JIANG Da-yu1,2
(1.College of Chemistry,Jilin Normal University,Siping 136000,China;2.Key Laboratory of Preparation and Applications of Environmmental Frendly Materials,Jilin Normal University,Ministry of Education China,Siping 136000,China;3.Siping Institute for Food and Drug Control,Siping 136000,Jilin,China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of three active components inFructus arctii.MethodsThe HPLC analysis was carried out on TC-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)column at the temperature of 25℃.The mobile phase composed of methanol and 0.4%glacial acetic acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·m in-1.The detection wavelength was280 nm shifted to 326 nm.The sample loading volume was10μL.ResultsThe linear range for chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 0.027 3-5.460 0,0.150 0-18.000 0,and 0.030 3-6.060 0μg,respectively.The linear equation was Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391,and Y=287.661X+ 4.045,respectively.The average recovery of chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 99.55%,99.42%and 99.40%, respectively.ConclusionThemethod is quick,accurate,and reproducible.It can be used for content determination and quality control forFructus arctii.

Fructus arctii;Chlorogenic acid;Arctiin;Arctigenin

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0100-03

2013-03-18

2013-04-18

*吉林省教育廳十二五基金項(xiàng)目(2012177)

孫艷濤(1979-),女,吉林遼源人,副教授,博士,主要從事色譜與光譜研究。電話：0434-3292154,E-mail：1979yanzi@163.com。

姜大雨(1972-),男,吉林延吉人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事色譜與光譜研究。電話：(0) 13224441430,E-mail：1979yanzi@163.com。