高效液相色譜切換波長法同時測定牛蒡子中活性成分的含量*

孫艷濤，趙蘭英，李婷婷，趙磊，姜大雨

(1.吉林師范大學化學學院，四平 136000；2.吉林師范大學環境友好材料制備與應用省部共建教育部重點實驗室，四平 136000；3.吉林省四平市食品藥品檢驗所，四平 136000)

高效液相色譜切換波長法同時測定牛蒡子中活性成分的含量*

孫艷濤1，2，趙蘭英1，李婷婷1，趙磊3，姜大雨1，2

(1.吉林師范大學化學學院，四平 136000；2.吉林師范大學環境友好材料制備與應用省部共建教育部重點實驗室，四平 136000；3.吉林省四平市食品藥品檢驗所，四平 136000)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)切換波長法同時測定牛蒡子中3種活性成分含量。方法應用TC-C18色譜柱(4.6 mm×250mm,5μm);流動相為甲醇-0.4%冰醋酸,梯度洗脫;流速1.0 mL·m in-1;檢測波長為280與326 nm切換;進樣量10μL;溫度25℃。結果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元分別在0.027 3～5.460 0,0.150 0～18.000 0和0.030 3～6.060 0μg范圍內呈良好線性,線性方程分別為Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391和Y= 287.661X+4.045;平均加樣回收率分別為99.55%,99.42%和99.40%。結論該方法快速、準確、重復性好,可用于牛蒡子中多組分含量的同時測定及質量控制。

牛蒡子；綠原酸；牛蒡子苷；牛蒡子苷元

牛蒡子來源于菊科兩年生草本植物牛蒡子屬牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果實［1］,為常用中藥,有疏風散熱、解毒透疹、利咽消腫等功效,現代藥理學研究表明牛蒡子有抗病毒、抗炎、抗癌、抑制熱休克反應等廣泛的藥理活性［2］。為建立高效液相色譜(HPLC)切換波長同時測定牛蒡子中3種活性成分含量,筆者首次利用切換波長法同時測定牛蒡子提取物中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的含量,可為其質量控制提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；GWA-UN4系列超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)；FA1104N萬分之一分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；SK5200H超聲波清洗器(上?？茖x器有限公司)。

1.2 試藥 牛蒡子苷對照品(上海同田生物技術有限公司,批號:12042835,含量:98.0%)；牛蒡子苷元對照品(上海同田生物技術有限公司,批號:12050336,含量:97.0%)；綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110753-200413,含量:96.6%)；牛蒡子藥材［來源:吉林省公主嶺市,經吉林省四平市食品藥品檢驗所中藥室鑒定為菊科植物牛蒡子屬牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果實］；甲醇為色譜純；冰醋酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元對照品,置10 mL量瓶中,加入適量甲醇溶解,并稀釋至刻度,即得濃度為273,1 500和303μg·mL-1的混合對照品溶液［3］。

2.2 供試品溶液的配制 按照《中華人民共和國藥典2010年版一部》第66頁中對于牛蒡子中牛蒡苷含量的測定方法進行樣品的處理:牛蒡子粉末(過孔徑0.300 mm藥篩)0.5 g,精密稱定,置于50 mL量瓶中；加甲醇約45 mL,超聲處理20 min,加甲醇稀釋刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得［4］。

2.3 色譜條件 色譜柱:TC-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流動相:A為甲醇,B為0.4%冰醋酸,梯度洗脫(0～25 min:40%～70%A；25～35 min:70%～40% A；35～40 min:40%～40%A)；流速:1.0 m L·min-1；檢測器:VWD檢測器；檢測波長:0～3 min,280 nm；3～6 min,326 nm；6～40 min,280 nm；柱溫:25℃；進樣量:10μL。

2.4 色譜圖 按照”2.3”項色譜條件分別取一定濃度綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元混合液和供試品溶液進樣。見圖1,2。

圖1 混合對照品溶液HPLC色譜圖1.綠原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.1 HPLC chromatogram of the m ixed reference solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

2.5 標準曲線的繪制 精密吸取“2.1”項條件下配制的對照品混合溶液,以0.1,0.5,1.0,3.0,5.0,7.0, 9.0和12.0μL為進樣量進樣,按照“2.3”項色譜條件測定峰面積。以進樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,實驗結果表明,3種活性成分的量均與峰面積呈良好的線性關系［5］,結果見表1。

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖1.綠原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.2 HPLC chromatogram of the test solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

表1 3種活性成分的線性關系方程Tab.1 Linear equation of 3 kinds of active ingredients

2.6 精密度實驗 精密吸取按照“2.2”項條件配制的一份樣品溶液,連續進樣五次進行測定,根據峰面積計算［6］。結果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分別為0.4%,0.2%和0.4%,表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性實驗 取藥材0.5 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備［6］,按上述色譜條件每隔4 h進行測定,共計進樣6次,測定其穩定性。統計結果表明,綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元峰面積(A)的RSD分別為1.1%, 0.8%,1.3%,表明藥材溶液在20 h內穩定。

2.8 重復性實驗 按照“2.2”項條件配制平行樣品溶液5份,進行含量測定。結果綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分別為0.4%,0.2%和0.3%,表明方法重復性良好［7］。

2.9 加樣回收率實驗 取牛蒡子藥材粉末約0.1 g,共6份,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,分別加入含綠原酸0.270 mg·mL-1,牛蒡子苷5.000mg·mL-1,牛蒡子苷元0.420 mg·mL-1的混合溶液(0.1,0.1,0.2,0.2, 0.3,0.3 mL),按照“2.2”項條件配制成樣品溶液,進行測定,并計算回收率。綠原酸的回收率為99.55%,牛蒡子苷的回收率為99.40%,牛蒡子苷元的回收率為99.42%,RSD均為0.3%。見表2。結果表明該方法具有良好的回收率。

2.10 樣品含量測定 按照“2.2”項條件配制平行樣品溶液5份,進行測含量測定。結果牛蒡子藥材中綠原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的平均含量分別為0.203,6.241和0.409 mg·g-1。

表2 3種活性成分加樣回收率實驗結果Tab.2 Recovery results of 3 kinds of active ingred ients

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 利用紫外分光光度計對綠原酸、牛蒡苷和苷元進行光度掃描,發現綠原酸在326 nm處有最大紫外吸收,而牛蒡子苷和牛蒡子苷元在280 nm處有最大紫外吸收,故含量測定時分別采用最大吸收波長為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 實驗分別選用甲醇∶水；甲醇∶0.1%冰醋酸；甲醇∶0.4%冰醋酸；作為實驗條件,結果發現在初始比例為甲醇∶0.4%冰醋酸(40∶60)時,進行梯度洗脫的時候,岀峰能夠很好地分離,峰形很好,縮短分析時間。

［1］王潞,趙烽,劉珂.牛蒡子苷元誘導人白血病細胞凋亡的作用及機制[J].藥學學報,2008,43(5):542-547.

［2］蔣淑敏.牛蒡化學成分和藥理作用的研究現狀[J].時珍國醫國藥,2001,12(10):941-942.

［3］劉世名,董國霞,陳靠山.牛蒡葉中綠原酸的提取工藝優化[J].中國藥學雜志,2003,38(9):659-661.

［4］劉世名,陳靠山.牛蒡葉中微量木脂體牛蒡子苷和牛蒡子苷元的分離與鑒定[J].色譜,2003,21(1):52-55.

［5］郝林華,陳靠山,李光友.耐鹽植物牛蒡的研究進展與應用[J].海洋科學,2004,28(5):69-72.

［6］米靖宇,汪志超,宋純清.高效液相色譜法測定不同采購地牛蒡子中牛蒡子苷和苷元的含量[J].時珍國醫國藥, 2004,15(11):737-739.

［7］雷海民,畢葳,李強,等.不同產地牛蒡子藥材RP-HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材,2006,29(11):1166-1168.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.029

Determination of Effective Constituents in Fructus Arctii by Wavelength Switching Method of HPLC

SUN Yan-tao1,2,ZHAO Lan-ying1,LI Ting-ting1,ZHAO Lei3,JIANG Da-yu1,2
(1.College of Chemistry,Jilin Normal University,Siping 136000,China;2.Key Laboratory of Preparation and Applications of Environmmental Frendly Materials,Jilin Normal University,Ministry of Education China,Siping 136000,China;3.Siping Institute for Food and Drug Control,Siping 136000,Jilin,China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of three active components inFructus arctii.MethodsThe HPLC analysis was carried out on TC-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)column at the temperature of 25℃.The mobile phase composed of methanol and 0.4%glacial acetic acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·m in-1.The detection wavelength was280 nm shifted to 326 nm.The sample loading volume was10μL.ResultsThe linear range for chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 0.027 3-5.460 0,0.150 0-18.000 0,and 0.030 3-6.060 0μg,respectively.The linear equation was Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391,and Y=287.661X+ 4.045,respectively.The average recovery of chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 99.55%,99.42%and 99.40%, respectively.ConclusionThemethod is quick,accurate,and reproducible.It can be used for content determination and quality control forFructus arctii.

Fructus arctii;Chlorogenic acid;Arctiin;Arctigenin

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0100-03

2013-03-18

2013-04-18

*吉林省教育廳十二五基金項目(2012177)

孫艷濤(1979-),女,吉林遼源人,副教授,博士,主要從事色譜與光譜研究。電話：0434-3292154,E-mail：1979yanzi@163.com。

姜大雨(1972-),男,吉林延吉人,副教授,博士,碩士生導師,主要從事色譜與光譜研究。電話：(0) 13224441430,E-mail：1979yanzi@163.com。