表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素致小鼠心臟毒性的預防作用*

李麗,唐燕霞,黃志明,陳潤麗,周煥第,劉布鳴,梁鋼

(1.廣西醫科大學藥學院,南寧 530021;2.廣西中醫藥大學藥學院,南寧 530001;3.廣西中藥質量標準研究重點實驗室,南寧 530022)

·藥物研究·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素致小鼠心臟毒性的預防作用*

李麗1,2,唐燕霞1,黃志明1,陳潤麗1,周煥第2,劉布鳴3,梁鋼1

(1.廣西醫科大學藥學院,南寧 530021;2.廣西中醫藥大學藥學院,南寧 530001;3.廣西中藥質量標準研究重點實驗室,南寧 530022)

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對柔紅霉素(DNR)所致小鼠心臟毒性的預防作用。方法將合格小鼠隨機分為4組,即正常對照組、模型對照組(DNR致心臟毒性組)、EGCG高劑量組(80 mg·kg-1)、EGCG低劑量組(40 mg·kg-1)。給予EGCG 7 d后,除正常對照組外,其余各組小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1)。48 h后檢測心電圖、血清心肌酶譜、高敏肌鈣蛋白T(TNT-Hs)、心肌超微結構。結果模型對照組小鼠心律失常發生率64.7%,丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥基丁酸脫氫酶(α-HBDH)和TNT-Hs顯著高于正常對照組(P＜0.01),心肌超微結構明顯損傷;EGCG高劑量組小鼠心律失常發生率44.4%,EGCG低劑量組小鼠心律失常發生率31.6%;EGCG各劑量組小鼠血淸心肌酶及TNTHs較模型對照組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);EGCG低劑量組小鼠心肌超微結構損傷較模型對照組明顯減輕。結論EGCG對DNR所致小鼠心臟毒性有一定的預防作用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;柔紅霉素;心臟毒性;心肌酶

柔紅霉素(daunorubicin,DNR)屬于蒽環類藥物。蒽環類藥物是一類非常有效且常用的抗腫瘤藥物,抗腫瘤譜較廣。在臨床化療方案中,蒽環類藥物的作用呈現出明顯的劑量-效應關系,但隨著劑量的增加,其不良反應也愈加突出,尤其是心臟毒性,使其應用受到了限制,目前尚無較理想的藥物能夠預防和治療[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗炎、抗腫瘤及防治糖尿病腎病的作用[2-3]。研究發現,EGCG可以緩解DNR引起的裸鼠體質量減輕,對DNR引起的裸鼠血液中心肌肌鈣蛋白T(troponin T, cTnT)和膜脂質過氧化產物丙二醛(malondialdehyde, MDA)升高有抑制作用[4]。但EGCG對DNR所致小鼠心臟毒性有無保護作用,筆者未見報道。筆者在本研究中建立DNR致小鼠急性心臟毒性模型,觀察EGCG對心電圖、心肌酶譜、高敏肌鈣蛋白T(highsensitivity troponin T,TNT-Hs)、心肌超微結構等的影響,探討EGCG對DNR致心臟毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠,清潔級,80只,雌雄各半,體質量(20±2)g,購自廣西醫科大學實驗動物中心。實驗動物使用許可證號:SYXK(桂)2009-0004,實驗動物生產質量合格證號:SCXK桂2009-0002。

1.2 藥物與試劑 DNR(Actavis Italy S.p.A.,批號: 1F10111)。EGCG(含量:97%,HPLC法,杭州禾田生物技術有限公司,批號:20100125,臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液)。丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase,ALT,批號:20130403)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase,AST,批號: 20130401)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH,批號:20130405)試劑盒為上海執誠生物科技股份有限公司產品;肌酸激酶(creatine kinase,CK,批號: 20130205)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB,批號:20130210)、α-羥基丁酸脫氫酶(alpha hydroxybutyrate dehydrogenase,α-HBDH,批號:20130201)試劑盒為德賽診斷系統(上海)有限公司產品。TNT-Hs檢測試劑盒(批號:20130418)為羅氏公司產品。

1.3 儀器 BL-420E生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司);7600-020AutomaticAnalyzer (HITACHI);羅氏Cobas 6000;H-7650型透射電鏡(日本日立)。

1.4 模型的制備及給藥 健康小鼠適應性喂養1周后,檢測心電圖,取正常者采用隨機數字表進行完全隨機化分組,共分為4組,即正常對照組、模型對照組、EGCG高劑量組(80 mg·kg-1)、EGCG低劑量組(40 mg·kg-1)。每組20只,雌雄各半。EGCG各劑量組分別灌胃給藥(20 mL·kg-1),正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積溶劑,即0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。每天1次,共7 d。在末次灌胃給藥1 h后,除正常對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液外,其余各組小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1),復制DNR急性心臟毒性模型[5]。

1.5 觀察指標

1.5.1 癥狀和體征 觀察小鼠一般生長狀況、外觀、飲食等。

1.5.2 心電圖 注射DNR 48 h后,小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥固定,采用標準肢體II導聯描記心電圖,觀察心律失常的發生率。本實驗中,出現各種類型的期前收縮、房室傳導阻滯、竇性心動過速、竇性心動過緩等之一者為心律失常陽性[6]。

1.5.3 TNT-Hs測定 采用化學發光法檢測血清TNT-Hs含量。

1.5.4 血清ALT、AST和心肌酶譜 記錄心電圖后,小鼠摘眼球取血,分離血清,在全自動生化分析儀上測定ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性。

1.5.5 電鏡觀察 小鼠采血后,迅速開胸取心臟,用預冷0.9%氯化鈉溶液沖洗,濾紙吸干后稱質量。取心尖部米粒大小心肌,2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定,丙酮脫水,樹脂包埋,超薄切片,1%醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0版統計軟件,實驗數據計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組樣本率比較采用Fisher's確切概率法,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGCG對DNR致心臟毒性小鼠一般狀況的影響 正常對照組小鼠活動、攝食、糞便、皮毛等生長狀況良好;腹腔注射DNR后1 d,模型對照組小鼠出現活動遲緩、攝食減少、豎毛等;除正常對照組外,其余各組小鼠陸續出現死亡,最后剩余小鼠數為:模型對照組17只,EGCG高劑量組18只,EGCG低劑量組19只。但EGCG給藥組小鼠一般狀況好于模型對照組。

2.2 EGCG對DNR致心臟毒性小鼠心電圖的影響 注射DNR 48 h后,模型對照組小鼠心律失常發生率顯著高于正常對照組(P＜0.01);EGCG低劑量組與模型對照組比較,心律失常發生率有所降低(P＜0.05)。結果見表1。

2.3 EGCG對DNR致心臟毒性小鼠血清TNT-Hs的影響 模型對照組血清TNT-Hs顯著高于正常對照組(P＜0.01)。與模型對照組比較,EGCG高、低劑量組血清TNT-Hs顯著降低(P＜0.01),見表2。

表1 4組小鼠心電圖測定結果Tab.1 Determination results of electrocardiogramin four groups of mice

表2 4組小鼠TNT-Hs測定結果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

表2 4組小鼠TNT-Hs測定結果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1) TNT-Hs/ (ng·mL-1)正常對照組20…0.04±0.01模型對照組17…0.23±0.06*1EGCG高劑量組18800.06±0.01*2低劑量組19400.06±0.02*2

2.4 EGCG對DNR致心臟毒性小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜的影響 模型對照組血清ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性均顯著高于正常對照組(P＜0.01)。EGCG高、低劑量組血清ALT、AST和心肌酶活性較模型對照組明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),見表3。

表3 4組小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜測定結果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

表3 4組小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜測定結果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1)ALTASTCKLDHCK-MBα-HBDH正常對照組20…57.6±15.4135.7±30.6597.9±357.4712.7±246.5401.2±97.9256.1±102.3模型對照組17…105.9±49.8*1349.3±115.3*12 272.4±606.5*11 349.2±301.0*11 039.79±249.4*1551.8±179.3*1EGCG高劑量組188060.8±14.1*2232.6±33.3*21 711.3±657.3*3955.4±276.6*2889.7±145.7*3370.1±118.1*2低劑量組194062.6±40.1*2254.2±58.0*21 422.2±504.8*2747.0±119.9*2807.9±136.2*2282.2±55.6*2

2.5 EGCG對DNR致心臟毒性小鼠心肌超微結構的影響 正常對照組心肌細胞排列有序,肌纖維肌小節結構清晰,線粒體含量豐富,包膜完整,線粒體嵴密度適中(圖1A)。與正常對照組相比,模型對照組心肌細胞腫脹,部分肌絲斷裂,排列紊亂,線粒體腫脹,線粒體嵴出現斷裂(圖1B)。EGCG低劑量組心肌細胞心肌纖維結構基本正常,少數線粒體嵴斷裂,個別肌絲溶解,線粒體腫脹較輕,心肌損傷明顯輕于模型對照組(圖1C)。

3 討論

人應用DNR治療時,當DNR的累積劑量超過300 mg·(m2)-1,易出現嚴重的心臟毒性,其早期急性心臟毒性的特征性之一表現為心律失常[7-8],因此心電圖是監測DNR心臟毒性的重要指標之一。研究表明,在人類肝臟中廣泛存在的羰基還原酶1能將DNR轉化成一種新的醇代謝物柔紅霉素醇。這種新生成的醇代謝物不僅抗腫瘤活性比DNR低,還會對心臟產生毒性,造成心肌細胞損傷[9]。心肌細胞膜受損,細胞內的多種酶外漏,如LDH、CK等,嚴重影響細胞功能[10]。因此,血清ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)是臨床反映心肌損害的主要生化指標,其可信度高,重復性好。TNT-Hs為心肌結構蛋白,在心肌細胞膜完整時,不能透過細胞膜進入血循環,因此正常人血清中含量極微。而當心肌細胞因缺血缺氧受到損傷時,由于細胞膜的通透性增高,TNT-Hs通過細胞膜進入外周血。TNT-Hs是心肌細胞損傷的高敏感性標志物,可檢出某些心肌酶譜不能檢出的微小心肌損傷,逐漸成為診斷心肌損傷首選的血清標志物[11]。本實驗表明,單次腹腔注射DNR 15 mg·kg-1可誘發小鼠心律失常,ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH水平升高,TNT-Hs釋放增多,心肌超微結構明顯損傷,DNR致小鼠心臟毒性模型復制成功。

A.正常對照組(×15 000);B.模型對照組(×15 000);C.EGCG低劑量組(×20 000)圖1 EGCG對DNR致心毒性小鼠心肌超微結構的影響A.Normal control group(×15 000);B.model control group(×15 000);C.EGCG 40 mg·kg-1group(×20 000)Fig.1 Effect of EGCG on myocardial ultrastructure of mice with DNR-induced cardiotoxicity

EGCG藥理作用廣泛,不僅具有抗氧化、抗紫外線輻射、抗菌等作用,還具有抗癌、抗突變、預防和治療心腦血管系統疾病以及調理內分泌、免疫系統等生物活性[12]。EGCG能增強阿糖胞苷對人白血病HL-60細胞的抗腫瘤活性[13]。在裸鼠肝癌移植瘤實驗中,EGCG可有效抑制羰基還原酶的代謝活性,增強DNR抗腫瘤作用并降低其心臟毒性[4]。本研究結果顯示,預先給予EGCG,可以改善DNR所致心臟毒性小鼠的一般生長狀況,降低心律失常發生率,抑制血清心肌酶增高,降低血清TNT-Hs含量,減輕心肌超微結構損傷,從而預防DNR的心臟毒性,其可能機制是通過抑制羰基還原酶,減少DNR代謝為柔紅霉素醇。由此筆者設想EGCG與DNR聯用,可能既預防或減輕DNR對心肌的損傷,又協同或增強DNR的抗腫瘤作用。這一研究結果或可為腫瘤的藥物防治提供新的思路,也將為EGCG的進一步研發提供實驗依據。

[1] 呂俊,丁念,朱家薔,等.蒽環類藥物心臟毒性及其預防的研究進展[J].中國醫院藥學雜志,2008,28(15): 1302-1303.

[2] 劉禮,謝紀文,王熙.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的抗腫瘤機制及放射增敏作用的研究進展[J].中西醫結合研究,2009,1(4):222-224.

[3] 李彩蓉,楊曉,朱忠華,等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療大鼠糖尿病腎病[J].醫藥導報,2005,24(10):877-879.

[4] HUANG WX,DING L Y,HUANG Q,et al.Carbonyl reductase 1 as a novel target of(-)-Epigallocatechin Gallate against hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,52 (2):703-714.

[5] 賴永洪,翟鶯鶯,葉鐵真.槲皮素對柔紅霉素所致心肌損傷的保護作用[J].現代臨床醫學生物工程學雜志, 2005,11(1):15-18.

[6] 裴天仙,徐長慶,李濱,等.槲皮素對多柔比星致小鼠心肌損傷的保護作用及其機制[J].藥學學報,2007,42 (10):1029-1033.

[7] DAVIES K J,DOROSHOWJ H.Redox cycling of anthracyclines by cardiac mitochondria.I.Anthracycline radical formation by NADH dehydrogenase[J].J Biol Chem,1986, 261(7):3060-3067.

[8] 莊艷,劉先領.蒽環類藥物心臟毒性及其預防措施[J].腫瘤藥學,2011,1(4):322-326.

[9] FORREST G L,GONZALEZ B,TSENG W,et al.Human carbonyl reductase overexpression in the heart advances the developmentofdoxorubicin-inducedcardiotoxicityin transgenic mice[J].Cancer Res,2000,60(18):5158-5164.

[10] 周致,陳瑗.自由基醫學基礎與病理生理[M].北京:人民衛生出版社,2002:369.

[11] 劉祥紅,胡紅霞.三項心肌標志物定量檢測對急性心肌梗死診斷的臨床意義[J].寧夏醫學雜志,2012,34(8): 787-788.

[12] 蔣莎莉,羅招陽.表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗腫瘤作用的研究進展[J].中外醫學研究,2009,7(14):64-65.

[13] 戴建子,徐峰,傅曉霞,等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯增強阿糖胞苷對HL-60細胞的抗腫瘤活性[J].中國醫院藥學雜志,2002,22(8):458-461.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.001

Protective Effects of(-)-Epigallocatechin Gallate on Daunorubicin-induced Cardiotoxicity in Mice

LI Li1,2,TANG Yan-xia1,HUANG Zhi-ming1,CHEN Run-li1,ZHOU Huan-di2,LIU Bu-ming3,LIANG Gang1
(1.Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Pharmaceutical College, Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;3.Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards,Nanning 530022,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of(-)-epigallocatechin gallate(EGCG)on daunorubicin (DNR)-induced cardiotoxicity in mice.MethodsThe qualified mice were randomly divided into four groups:normal control group,myocardial injured model control group,high dose group(80 mg·kg-1)and lowdose group(40 mg·kg-1)of EGCG. EGCG was administered intragastrically once daily for 7 days,followed by a single intraperitoneal injection of DNR(15 mg·kg-1) except in the normal control group.The electrocardiogram,myocardial enzymes and TNT-Hs in serum,cardiac ultrastructure of mice were detected after 48 h.ResultsIn DNR model control group,the incidence of arrhythmia was 64.7%.The activity of serumcardic enzymes including CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs were significantly higher than those in the normal control group(P＜0.01),and myocardial ultrastructure was injured remarkably.The incidence of arrhythmia was 44.4%in mice treated with high dose of EGCG and 31.6%in mice with lowdose of EGCG.Compared to the model control group,the activity of CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs in serumdecreased remarkably in EGCG groups(P＜0.05 or P＜0.01).Lowcan EGCG alleviated the injury to the ultrastructure of myocardiumcompared to the model control group.ConclusionEGCG can prevent the cardiac toxicity induced by DNR in mice.

(-)-Epigallocatechin gallate;Daunorubicin;Cardiotoxicity;Myocardial enzymes

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0841-04

2013-08-28

2013-09-22

*國家自然科學基金資助項目(81160532);教育部博士點基金博導類課題(20134503110007);廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA053147);廣西中藥質量標準研究重點實驗室(廣西壯族自治區中醫藥研究院)開放課題基金項目(桂中重開201105)

李麗(1973-),女,廣西東蘭人,副教授,碩士生導師,博士,主要從事中草藥藥效及抗腫瘤分子藥理學研究。電話:0771-2279423,E-mail:lilygxnn@163.com。

梁鋼(1957-),男,廣東順德人,教授,博士生導師,博士,主要從事抗腫瘤分子藥理學及其新藥的研究。電話: 0771-5302271,E-mail:lianggang22@aliyun.com。