Rho激酶抑制劑DL0805-0對大鼠離體胸主動脈的舒張作用及機制研究

閻 雨，王夙博，袁天翊，焦曉臻，謝 平，方蓮花，，杜冠華，

Rho激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein serine／threonine kinase，ROCK）是小G蛋白Rho的底物，具有絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶活性，廣泛分布于腦、心臟、肺等大部分器官，具有多種重要功能［1］。研究發現它與高血壓、心肌重構、心力衰竭、心肌缺血及動脈粥樣硬化的發生發展密切相關［2－3］。目前，ROCK已成為治療心血管疾病的新的藥物靶點［4－5］。

5-硝基-1（2）氫-吲唑-3腈（簡稱 DL0805，Fig 1 A）是在前期高通量藥物篩選中發現的具有Rho激酶抑制活性的化合物［6］。研究表明［7－8］，DL0805具有良好的舒張血管活性。4-（4-氟苯基）-N-｛5-（1H-吲唑）｝-2-甲基-6-羰基-1，4，5，6，-四氫-3-吡啶甲酰胺（簡稱DL0805-0，Fig 1 B）與DL0805具有相同的吲唑母核，是DL0805經過結構優化獲得的具有Rho激酶抑制活性的化合物，與文獻報道一致［9］。本實驗采用離體大鼠胸主動脈環張力測定方法，觀察DL0805-0對高鉀和去甲腎上腺素（noreponephrine，NE）刺激的大鼠胸主動脈環的舒張作用并探討其可能的作用機制。

Fig 1 Structures of DL0805 and DL0805-0

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器、藥品和試劑 NE、乙酰膽堿（acetycholine，ACh）、吲哚美辛、左旋硝基精氨酸甲醋（Nωnitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）、亞甲藍、四乙胺（tetraethyl ammonium，TEA）、格列本脲、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、鹽酸法舒地爾均購自美國Sigma公司；DL0805-0由中國醫學科學院藥物研究所謝平教授課題組提供（分子質量：363.37），純度＞95%（HPLC測定），臨用前用二甲基亞砜（DMSO）溶解。MP100A生理信號記錄分析系統購自美國BIOPAC公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級♂ SD大鼠，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證編號 SCXK（京）2012－001］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動脈環的制備 斷頭處死大鼠，迅速取出胸主動脈，置于95%O2和5%CO2混合氣預飽和的4℃ Krebs-Henseleit（K-H）液中。洗去殘血，仔細剔除血管周圍脂肪和結締組織，避免過度牽拉，將血管條剪成3～4 mm的血管環標本。根據實驗需要，去內皮的血管，用棉簽輕輕摩擦血管環內表面以去除內皮。小心地將兩個不銹鋼三角環穿入到血管環中，將一端固定于浴槽底部，另一端連于張力換能器，浴槽中加入8 ml K-H液，維持37℃，充入95%O2和5%CO2的混合氣體。調節初始張力為1.2 g，穩定1.5 h，期間換 K-H液1次。用含60 mmol·L-1KCl的高鉀K-H液使血管平滑肌去極化，達最大收縮，檢測標本的反應性。用K-H液反復沖洗至基線，重新平衡30 min。采用經典的乙酰膽堿內皮鑒定，以確定內皮是否完整或去內皮是否完全。加入終濃度0.1μmol·L－1的NE刺激收縮達到平臺期后，加入終濃度1μmol·L－1的 ACh，如果ACh能引起血管舒張達到60%以上則認為內皮完整，如果低于5%則認為內皮己經被完全去除。用K-H液反復沖洗至基線，以進行下一步實驗。

1.2.2 DL0805-0對KCl預收縮胸主動脈血管環的舒張作用 內皮完整的血管環，用含60 mmol·L－1KCl的高鉀K-H液使血管環收縮并達到穩定后，分別累積加入DL0805-0或法舒地爾，終濃度依次為1、2.5、5、10、20μmol·L－1，溶劑對照組加入相同體積的溶劑（DMSO），每5 min加藥1次。以每次加入藥物5 min后的血管收縮張力與KCl誘發的血管環的最大收縮張力之間的比值反映血管張力的變化。

1.2.3 DL0805-0對NE預收縮胸主動脈血管環的舒張作用 參照“1.2.2”步驟，加入0.1μmol·L－1的NE預孵育后，分別累積加入DL0805-0或法舒地爾，終濃度依次為0.1、0.2、0.5、1、2.5、5μmol·L－1。

1.2.4 內皮對DL0805-0舒張血管作用的影響 內皮完整的血管環，分別加入一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME（100μmol·L－1）、鳥苷酸環化酶抑制劑亞甲藍（5μmol·L－1）、環氧化酶抑制劑吲哚美辛（5 μmol·L－1），預孵育 20 min。加入 0.1μmol·L－1的NE預孵育，待血管環收縮達到穩定后，分別累積加入 DL0805-0，終濃度依次為 0.1、0.2、0.5、1、2.5、5μmol·L－1，溶劑對照組處理同上，每5 min加藥1次。以每次加入藥物5 min后的血管收縮張力與NE誘發的血管環的最大收縮張力之間的比值反映血管張力的變化。

1.2.5 鉀通道對DL0805-0舒張血管作用的影響內皮去除的血管環，分別加入鈣激活鉀通道阻滯劑TEA（5 mmol·L－1）、ATP敏感鉀通道阻滯劑格列本脲（10μmol·L－1）和電壓依賴鉀通道阻滯劑4-AP（100μmol·L－1），參照“1.2.4”步驟。

1.2.6 DL0805-0對NE誘導的內鈣依賴性收縮的影響 內皮去除的血管環，用含 50μmol·L－1EGTA的K-H液沖洗2次，每次維持10 min，換用不含EGTA的無鈣K-H液平衡至基線水平。加入DL0805-0，終濃度分別為 0.1、1、5μmol·L－1，溶劑對照組處理同上。預孵育20 min后，加入1μmol·L－1的NE。以加入NE 15 min后的血管收縮張力與NE誘發的血管環的最大收縮張力之間的比值反映血管張力的變化。

1.2.7 DL0805-0對復鈣誘導的外鈣依賴性血管收縮的影響 參照“1.2.6”步驟，沖洗后換用含60 mmol·L－1KCl的無鈣高鉀K-H液平衡至基線水平。不同劑量的DL0805-0預孵育20 min后，累積加入 CaCl2溶液，終濃度依次為 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5μmol·L－1，每 5 min加 CaCl2溶液 1次。以每次加入CaCl2溶液5 min后的血管收縮張力與KCl誘發的血管環的最大收縮張力之間的比值反映血管張力的變化。

1.2.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 5統計軟件進行統計學分析，所有數據均以ˉx±s表示，多組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 DL0805-0對高濃度KCl預收縮胸主動脈血管環的舒張作用 DL0805-0能夠劑量依賴性地抑制高濃度KCl所致的主動脈環收縮，其舒張作用強度與Rho激酶抑制陽性藥法舒地爾比較差異無顯著性（Fig 2），兩者pEC50分別為5.48±0.21和5.25±0.33。

2.2 DL0805-0對NE預收縮胸主動脈血管環的舒張作用 DL0805-0能劑量依賴性的舒張1μmol·L－1NE預收縮的大鼠胸主動脈環，且與法舒地爾的作用差異無顯著性。在內皮完整的大鼠胸主動脈環DL0805-0和法舒地爾pEC50分別為6.74±0.34和6.26±0.17，在內皮去除的大鼠胸主動脈環其pEC50分別為6.14±0.11和5.89±0.10。DL0805-0濃度為0.1、0.2、0.5μmol·L－1時對內皮完整血管環的舒張作用明顯強于內皮去除的血管環，濃度為1、2.5、5μmol·L－1時舒張作用相似（Fig 3）。

Fig 2 Vasorelaxant effect of DL0805-0 or fasudil on rat thoracic aortic rings contracted by KCl（60 mmol·L－1）.（ˉx±s，n＝6）

2.3 內皮對DL0805-0舒張血管作用的影響 LNAME可明顯抑制0.2、0.5、1μmol·L－1DL0805-0對NE預收縮血管的舒張作用，而亞甲藍和吲哚美辛對DL0805-0舒張血管作用無明顯影響（Fig 4）。

2.4 鉀通道對DL0805-0舒張血管作用的影響TEA可抑制 0.1、0.2、0.5μmol·L－1DL0805-0對NE預收縮血管的舒張作用，而格列本脲和4-AP對DL0805-0的舒張血管作用均無明顯影響（Fig 5）。

2.5 DL0805-0對NE誘導的內鈣依賴性收縮和復鈣誘導的外鈣依賴性收縮的影響 1、5μmol·L－1DL0805-0均能夠明顯抑制NE在無鈣K-H液中引起的血管收縮效應（Fig 6A）。1、5μmol·L－1DL0805-0能夠明顯抑制CaCl2在無鈣高鉀K-H液中引起的血管收縮效應（Fig 6B）。

3 討論

生理條件下，高鉀可激活平滑肌細胞膜上電壓依賴性鈣通道，細胞外鈣內流，促進血管收縮［10］。NE激活血管平滑肌細胞膜上受體操控性鈣通道，促進細胞外鈣內流，同時還觸發平滑肌細胞肌漿網釋放鈣離子，使［Ca2＋］i升高，血管收縮［11］。本研究結果顯示，DL0805-0能劑量依賴性抑制KCl和NE引起的血管收縮，作用強度類似于陽性藥法舒地爾，說明DL0805-0具有明顯的舒張血管作用。

內皮通過釋放各種血管活性物質如舒張血管活性物質NO、前列環素，以及促進血管收縮的活性物質如內皮素、血管緊張素Ⅱ等［12－13］調節血管張力。去除內皮后，在低濃度下DL0805-0舒張血管的作用明顯減弱，提示其舒張血管作用可能部分依賴于內皮的存在。一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME和鳥苷酸環化酶抑制劑亞甲藍分別通過不同途徑阻斷NO舒張血管的作用，環氧合酶抑制劑吲哚美辛通過抑制前列腺素I2合成，減弱前列環素舒張血管的活性。實驗結果顯示，L-NAME可明顯抑制DL0805-0對NE收縮血管的舒張作用，而亞甲藍和吲哚美辛無明顯影響，表明DL0805-0依賴內皮的舒張血管作用可能與調控NO的合成有關，而與前列腺素I2無關。

Fig 3 Vasorelaxant effect of DL0805-0 or fasudil on rat thoracic aortic rings pre-contracted by NE（10－7 mol·L－1）

Fig 4 Effect of pre-incubation of methylene blue，L-NAME and indomethacin on DL0805-0 induced relaxation in endothelium-intact aorta（ˉx±s，n＝6）.

Fig 5 Effect of pre-incubation of TEA，glibenclamide and 4-AP on DL0805-0 induced relaxation in aorta（ˉx±s，n＝6）.

K＋通道在調節血管平滑肌作用中占有重要地位，激活血管平滑肌上的K＋通道能引起細胞膜超極化，抑制細胞外鈣內流，使血管舒張［10］。結果表明，TEA可抑制低濃度的DL0805-0舒張血管的作用，而格列本脲和4-AP對其舒張血管作用無明顯影響，說明DL0805-0的舒張血管作用可能與直接開放血管平滑肌細胞上鈣激活的鉀離子通道有關。

細胞內鈣離子在血管平滑肌細胞的收縮中起著關鍵的作用。正常情況下，細胞內鈣離子濃度較低，細胞“興奮”時，細胞內鈣離子濃度升高，引起細胞收縮。細胞內鈣升高主要有兩條途徑，即細胞外鈣內流和細胞內鈣釋放［11］。本實驗結果發現DL0805-0（1、5μmol·L-1）能明顯抑制NE在無鈣K-H液中引起的血管收縮效應，提示DL0805-0能明顯抑制細胞內Ca2＋釋放。

Fig 6 Inhibitory effect of DL0805-0 on contraction induced by intracellular Ca2＋ release and extracellular Ca2＋ influx

在無鈣高鉀K-H液中，伴隨著CaCl2的加入，高鉀使細胞外Ca2＋經電壓依賴性鈣通道進入細胞內，導致血管收縮。本實驗發現，DL0805-0（1、5μmol·L－1）明顯抑制累積加入的CaCl2在無鈣高鉀K-H液中引起的血管收縮效應，說明DL0805-0能明顯抑制細胞外Ca2＋內流。

綜上所述，作為一個與DL0805具有相同吲唑母核的新型Rho激酶抑制劑，DL0805-0表現出與陽性藥法舒地爾強度相似的舒張血管作用。其舒張血管效應可能部分依賴于血管內皮，同時開放血管平滑肌細胞上鈣激活的鉀離子通道以及阻滯鈣離子通道也是其舒張血管的重要作用機制。提示其具有潛在的治療高血壓等心血管疾病的作用。

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