參麥注射液對大鼠心臟細胞色素P450酶的調節作用

張紅曦，王宇光，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，董 志，高 月

參麥注射液源自《癥因脈治》中的參麥飲，是由等量的人參和麥冬提純后混合制成的中藥注射液，臨床用于治療心力衰竭、冠狀動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、肺心病、粒細胞減少等癥。其中，參麥注射液在心臟方面的臨床應用較為廣泛，尤其在西藥常規治療的基礎上顯示了一定的療效。近年來花生四烯酸細胞色素P450代謝酶與心血管疾病的相關性已有大量報道，提示花生四烯酸的CYP450環氧化物酶代謝物EETs具有心血管保護作用［1－4］；而花生四烯酸經細胞色素 P450（CYP450）羥化酶 ω-羥化后，生成的20-羥二十烷四烯酸（20-HETE）在心肌細胞肥大時濃度明顯的升高，即CYP羥化酶抑制劑對心臟起到保護作用［4－5］。本文從花生四烯酸細胞色素P450代謝酶方向，應用qPCR的方法探討了參麥注射液對其的調節作用，從心臟CYP系統探討參麥注射液對心臟的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物 實驗用SD大鼠（SPF級），♂，32只，體質量（200±10）g，由解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，實驗動物（飼料）許可證號：SCXK-（軍）2007-004；分籠飼養，每籠 4只，保持溫度22℃～24℃，濕度60%～65%，自由進食飲水，實驗動物實驗設施許可證號：SYXK-（軍）2007－004。

1.2 主要藥品與試劑 參麥注射液（生藥含量：紅參0.1 g·ml－1，麥冬0.1 g·ml－1）、紅參注射液（生藥含量：紅參0.1 g·ml－1）和麥冬注射液（生藥含量：麥冬0.1 g·ml－1）均由正大青春寶藥業提供，其中參麥注射液批號：1107201。RNA提取試劑盒為Biomed公司產品；反轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒為TransGen公司產品，SYBR Green SuperMix為Applied Biosystems公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器設備 電子天平（德國Sartorious BS223S），超低溫冰箱（Sanyo MDF-U53V），高速低溫離心機（Heraeus Labofuge 400R），水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司 HW·SYII-K），PCR儀［Gene-Amp PCR System 2400（PE Applied Biosystem）］；ABI StepOne／StepOnePlus實時熒光定量PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.4 動物分組及給藥方法 SD大鼠32只隨機分為4組，每組8只，分別為空白對照組（Control）、參麥注射液組（SMI）、紅參注射液組（HSI）和麥冬注射液組（MDI），以上各組動物均采取腹腔注射的方式分別給予參麥注射液（10 ml·kg－1·d－1）、紅參注射液（10 ml·kg－1·d－1）、麥冬注射液（10 ml·kg－1·d－1）、空白對照組給予等量生理鹽水，連續14 d，于d 15制取肝微粒體。

2 方法

2.1 大鼠心臟組織總RNA的提取 大鼠處死后迅速取出心臟，置于液氮中保存。按Biomed公司RNA提取試劑盒說明書提取心臟總RNA，取心臟組織50～100 mg，加1 ml裂解液勻漿混勻，在15～30℃條件下孵育5 min，加氯仿200μl，劇烈震蕩15 s后室溫孵育 3 min，4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，將上層水相移入新管中，加入1倍體積的70%乙醇，顛倒混勻。全部轉入吸附柱RA中，12 000 r·min－1離心45 s后棄掉廢液，加入500μl去蛋白液，12 000 r·min－1離心 45 s后棄掉廢液，加入 500 μl漂洗液，12 000 r·min－1離心 45 s后棄掉廢液，再次漂洗后13 000 r·min－1離心2 min，取出吸附柱RA，放入一個rNase free離心管中，在吸附膜中間部位加入50～80μl Rnase free water，室溫放置2 min，12 000 r·min－1離心1 min。用紫外分光光度計測定 A260／A280比值，用以檢測 RNA的純度，A260／A280比值大于1.7～1.9，可用于下一步的實驗。

2.2 實時熒光定量PCR 按TransGen公司一步法逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄實驗。取總RNA 1 μg，加入 2×TS Reaction Mix 10μl，TS RT／RI Enzyme Mix 1μl，Anchored Oligo（dT）1μl，加 RNasefree H2O至終體積為20μl并混勻。逆轉錄的條件為：42℃30 min，85℃5 min。產物在 －20℃ 保存備用。按ABI公司SYBR Green SuperMix試劑盒說明書進行qPCR實驗。取轉錄產物2μl，2×Fast SYBR Green Master Mix 10μl，特異性引物正義鏈和反義鏈各0.5μl，加RNase-free H2O至終體積為20μl并混勻，反應條件：起始變性95℃20 s，循環時95℃3 s，60℃30 s進行40個循環，最后熔解曲線95℃15 s，60℃1 min。特異性引物序列見Tab 1

3 結果

利用qPCR檢測3個不同的處理組，擴增多種CYP同工酶統計結果見Tab 2。

3.1 參麥注射液及其單藥對CYP1家族mRNA表達的影響 從結果看（Fig 1），與空白組相比較參麥注射液組對CYP1A1、CYP1B1 mRNA表達上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

Tab 1 Primer sequence of rat P450 isoenzymes in qPCR reaction analysis

Tab 2 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP isozymes by qPCR

3.2 參麥注射液及其單藥對CYP2家族mRNA表達的影響 從結果看（Fig 2），與空白組相比較參麥注射液組對CYP2C11、CYP2E1和CYP2J3 mRNA表達均有明顯的上調，差異具有統計學意義（P＜0.01），紅參注射液組對CYP2B1、CYP2E1 mRNA表達有明顯的上調作用，麥冬注射液組對CYP2B1和CYP2C11 mRNA表達有明顯的下調（P＜0.01）。

3.3 參麥注射液及其單藥對CYP4家族mRNA表達的影響 從結果看（Fig 3），除 CYP4A3、CYP4F6外，與空白組相比較參麥注射液組對CYP4家族mRNA表達均有明顯的上調，差異具有統計學意義（P＜0.01），紅參注射液組對 CYP4A3和 CYP4F1 mRNA表達有明顯的上調作用（P＜0.01），麥冬注射液組對CYP4 F1和CYP4F6 mRNA表達有明顯的上調（P＜0.01）。

3.4 參麥注射液及其單藥對ANP、BNP mRNA表達的影響 從結果看（Fig 4），與空白組相比較參麥注射液組對ANP、BNPmRNA表達有明顯的上調，差異具有統計學意義（P＜0.01），麥冬注射液組對ANP和BNP mRNA表達有明顯的上調（P＜0.01），紅參注射液組對ANP和BNP mRNA表達與空白組比較未發生改變。

Fig 1 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP 1 subfamily in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

3.5 參麥注射液及其單藥對 EPHX2mRNA表達的影響 從結果看（Fig 5），與空白組相比較參麥注射液組、紅參注射液和麥冬注射液對EPHX2mRNA表達均有上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

4 討論

參麥注射液已成為中醫臨床常用注射劑，在心血管疾病、糖尿病、血液疾病等多種臨床疾病中廣泛應用。趙敏等［6］證實，參麥注射液對大鼠局灶性腦缺血損傷有一定的保護作用；同時［7］研究顯示，參麥注射液有對抗大鼠心肌缺血／再灌注性心律失常作用；參麥注射液在改善急性心肌梗死大鼠心功能、左室重構作用方面也具有明顯作用［8］。本文以心臟P450酶為考察指標，探索參麥注射液對心臟細胞色素P450酶mRNA表達的影響，為深入研究參麥注射液心臟保護作用新的可能途徑提供線索。

Fig 3 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP 4 subfamily in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

Fig 4 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of ANP and BNP in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是人體最重要的代謝酶，參與生物體內源性物質（如類固醇激素、花生四烯酸等）和外源性物質（如藥物、環境致癌物等）的生物轉化［9］。花生四烯酸（AA）通過CYP途徑可產生兩類二十烷酸：經CYP表氧化酶代謝產生表氧－二十碳三烯（epoxyeicosatrienoicacid，EETs），包括 5，6-、8，9-、11，12-、14，15-EET 4種異構體；經CYPω-羥化酶代謝為羥－二十烷 四 烯 酸 （ hydroxyeicosatetraenoicacid，HETEs）。EETs作為內皮衍生的超級化因子主要成分，其具有的擴張血管、抗血栓纖溶和促缺血組織血管形成等作用，已證實在治療心腦缺血性疾病中有明顯療效。而HETE具有的縮血管則有加重疾病的可能。因此本文選擇與心血管疾病密切相關的CYP亞型，探討參麥注射液對上述亞型的影響，有助于發現參麥注射液新的作用靶點和探析參麥方的配伍規律。

Fig 5 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of EPHX2 in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

本實驗主要考察參麥注射液對細胞色素P450酶各亞家族中重要亞型mRNA表達的影響。其中CYP1、4家族是代謝花生四烯酸生成HETEs的主要合成羥化酶，而HETEs具有縮血管作用，與心血管疾病發病密切相關。目前尚未見參麥注射液對CYP1、4家族影響的報道，但是有報道指明AA經CYP4ω-羥化酶代謝所產生的20-HETE會擴大缺血／再灌注損傷［11］。本實驗結果顯示參麥注射液對CYP1、4家族中除CYP4A3和CYP4F6，其他各亞型具有不同程度的誘導作用，導致花生四烯酸代謝產生的HETE有增加的趨勢，進而可能加重心臟損傷。而對于CYP450中最為重要的CYP2家族，有報道顯示：CYP2J產生的EETs的心臟保護功能的機制與線粒體KATP通道有關，CYP2C9抑制劑具有心臟保護作用［12］。蘆玲巧等［13］研究發現心肌轉染重組質粒CYP2J3組能夠減少缺血期及再灌注期心肌梗死面積。CYP2J3作為最重要的環氧化物酶，參與代謝花生四烯酸生成EETs，EETs對心肌細胞功能有重要的影響。有研究表明，5，6-EET和11，12-EET能明顯增加大鼠心肌收縮力。在離體缺血／再灌注大鼠心臟模型，11，12-EET能明顯恢復缺血／再灌注后的心肌收縮力［14－15］。EETs可以上調 eNOS，產生血管舒張效應，在心臟保護方面有明顯作用［16］。本實驗結果顯示參麥注射液對CYP2J3有明顯的誘導趨勢，進而能增加花生四烯酸代謝成EETs，產生心臟的保護作用。

近年研究發現心房利鈉肽（ANP）和腦利鈉肽（BNP）在心臟負荷過重或心臟擴大時分泌增加［17］，可反映心臟的功能狀態。ANP和BNP同屬利鈉肽家族，都具有利鈉、利尿、舒張血管作用，在心功能不全時可拮抗交感神經、抗利尿激素和腎素－血管緊張素－醛固酮系統等神經內分泌因素的過度激活，從而起到維護心功能的作用［18］。本實驗顯示，參麥注射液對ANP、BNP均呈明顯誘導作用，其水平的上調有助于增強心臟的功能。

可溶性環氧化酶水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）是EETs代謝的主要酶類之一，可將EETs代謝為生物活性明顯減弱的二羥基-20碳三烯酸（dihydroxyicosatrienoic acids，DHET）。本實驗結果顯示參麥注射液對sEH基因（EPHX2）有明顯上調的作用，可能造成EETs轉化，心臟保護活性減弱。

綜合實驗結果發現，紅參注射液對CYP2B1具有誘導的作用，但麥冬注射液對其表現出的明顯的抑制作用，參麥注射液對CYP2B1的作用雖然沒有統計學意義，但具有誘導的趨勢，提示紅參注射液對CYP2B1的誘導作用可能強于麥冬注射液的抑制作用。參麥注射液對CYP2E1、CYP4F1和EHPX2的誘導，同時顯示紅參注射液與麥冬注射液均對CYP2E1、CYP4F1和EHPX2具有誘導作用，提示參麥注射液對其的誘導作用可能由復方中的紅參和麥冬共同貢獻。參麥注射液對ANP和BNP均具有誘導的作用，同時麥冬注射液也顯示出明顯的誘導，提示在對ANP和BNP的作用中麥冬比紅參的作用更強。

綜上，參麥注射液對CYP450酶的影響與心血管的保護作用是對各亞酶調節的綜合反映，參麥注射液對CYP2J3作用明顯，在細胞水平上也具有明顯的量效關系［19］，而對其他亞型作用，特別是CYP4家族的誘導作用弱于CYP2J3，因此CYP2J3產生的心臟保護作用明顯強于CYP4家族可能帶來的心臟損傷。由于CYP2J3、ANP和BNP等相關分子是心血管的重要靶點，而參麥注射液對心血管疾病療效明確，因此心臟P450酶系統可能是參麥注射液治療心血管疾病新的可能途徑或靶點，其對 CYP2J3、ANP和BNP誘導作用的分子機制及其與心血管疾病的發生關系有待進一步研究。

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