肌肽對皮層下缺血性血管性癡呆動物認知功能的保護作用

馬 婧，張 健，陳 忠

血管性癡呆是繼老年性癡呆之后，臨床發病率排第2位的認知障礙性疾病［1］。其中皮層下缺血性血管性癡呆（subcortical ischemic vascular dementia，SIVD）是第2大亞型，由慢性缺血／再灌注導致小血管疾病引起，多見于高血壓、動脈硬化患者。SIVD的主要病理表現為膠質細胞的激活和認知功能障礙［2］。目前對于SIVD的治療已經引起了廣泛的關注［3］。膽堿酯酶抑制劑、血管擴張藥等通過不同的機制，對SIVD發揮溫和的保護作用［4］，但是到目前為止還沒有針對SIVD的特效藥物［5］。

組胺是腦內一種重要的神經遞質，能夠參與攝食、運動功能和學習記憶等生理過程，發揮多種神經調節作用［6］。由于組胺能夠保護急性腦缺血損傷［7］，因此假定組胺對 SIVD可能也有保護作用。但是由于組胺不能通過血腦屏障，并且可能引起炎癥反應，限制了組胺的利用。

肌肽（β-丙氨酰-L-組氨酸，carnosine，Car）是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成，在肌肉和腦組織中高表達。肌肽是體內組胺的一個天然儲庫，能夠通過轉變為組氨酸然后成為組胺［8］。由于肌肽能夠由外周進入神經中樞系統，因而對神經系統疾病有保護作用。肌肽被認為具有抗炎性，抗氧自由基，pH緩沖劑等作用。肌肽通過肌肽－組氨酸－組胺的代謝途徑，改善缺血／再灌引起的急性腎功能衰竭［9］，還能夠通過抗氧化和抗凋亡作用對動物腦損傷發揮保護作用［10］。因此假設肌肽對SIVD有臨床治療作用，我們利用了永久性結扎小鼠右側頸總動脈（right unilateral common carotid arteries occlusion，rUCCAO）制作的模型來研究肌肽對SIVD誘導的動物認知功能的作用

1 材料

1.1 實驗動物 ♂ C57BL／6品系野生型小鼠（北京維通利華公司提供），體質量22～30 g，8～10周齡。動物飼養在溫度控制的環境（22±1）℃下，12 h明暗循環，分籠飼養并自由攝水飲食。所有行為學的實驗均在10∶00～17∶00間進行。實驗完全遵從NIH關于實驗動物照護和使用的規定。

1.2 化學試劑 肌肽購自美國Sigma公司。戊巴比妥鈉、無水乙醇、醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器 小動物恒溫孵育箱（英國 Peco Services Ltd公司）；小動物恒溫毯（美國 FHC公司）；條件恐懼性記憶的刺激器（Hamilton-Kinder company，CA，US）；水迷宮（Zhenghua Biologic Apparatus Facilities Co Ltd，Huaibei，China）；熱板測痛儀（山東省醫學科學院設備站）；運動量監測系統（Any maze，stoelting Co.，USA）

2 方法

2.1 動物模型制備 使用戊巴比妥鈉（60 mg·kg－1）腹腔注射麻醉動物，用體積分數為0.75的乙醇頸部消毒后，切開頸部正中的皮膚，將小鼠右側的頸總動脈和迷走神經鈍性分離，用6－0線永久性結扎小鼠右側頸總動脈（rUCCAO），分別縫合肌肉和頸部的皮膚，碘伏消毒。術后將小鼠放入35℃保溫孵育箱內，蘇醒后放入籠中飼養。假手術組除結扎外，其余的步驟和手術組一致［11］。

2.2 動物實驗分組 用生理鹽水溶解肌肽（carnosine，Sigma，美國）后進行腹腔注射。成年野生型小鼠手術后，給予生理鹽水（saline），肌肽（car，200，500或者750 mg·kg－1），手術前30 min給藥 1次，之后每隔1 d給藥1次直至動物被處死。麻醉蘇醒后動物分籠照顧，手術后27 d對小鼠進行運動量測定和敞箱實驗，手術后d 28時對小鼠進行熱板實驗，手術后d 29對小鼠進行2 d的恐懼記憶實驗，到手術后d 31進行3 d的水迷宮實驗。行為學檢測期間，每隔1 d的測試后給予肌肽。

2.3 運動量測定 為測定小鼠持續的運動量，把小鼠放入單獨的有機玻璃盒子中（30×30×30）cm3，在實驗手術后d 27時，采用運動量監測系統，將不同組的小鼠依次放入盒子，測定小鼠3 min和6 min內所走過的距離［12］。

2.4 敞箱實驗 用自制的敞箱（30×30×30）cm3進行敞箱實驗，在實驗手術d 27運動量監測后進行，將不同組的小鼠依次放入敞箱中，底面由面積相等的邊長10 cm劃分的9塊正方形組成。記錄小鼠在3 min和6 min內在中間正方形內探索時間［12］。

2.5 熱板實驗 等熱板的溫度達到（47.5±0.1）℃后，將小鼠置于熱板上同時開始計時。當實驗小鼠表現出抬爪、舔爪或甩爪的反應時停止計時。為防止熱板的刺激對小鼠的傷害，實驗測試時間不超過70 s。實驗平行測試3組（間隔2 h），取平均值為小鼠熱痛的閾值。

2.6 恐懼記憶實驗 在手術后d 29時進行恐懼學習記憶能力檢測。實驗開始將小鼠放入訓練盒內訓練，適應120 s后，給予2 800 Hz，84 dB的聲音刺激30 s（條件刺激），在聲音刺激最后2 s同時給予電流刺激0.3 mA（非條件刺激），刺激結束后，待小鼠在訓練盒內停留30 s后取出。訓練實驗結束后24 h，進行背景和線索記憶的測試。測試實驗按照訓練時的順序，將小鼠放入訓練盒內，不給任何刺激，觀察5 min內出現恐懼反應的百分比。然后將小鼠放入新的環境（新的盒子），適應120 s后，僅給予訓練時的聲音刺激360 s，不給予電流刺激，觀察恐懼反應出現的百分比。恐懼反應出現的百分比是通過計數每5 s內恐懼反應的出現與否而得到的［12］。

2.7 水迷宮實驗 水迷宮實驗應用于檢測轉基因或者基因敲除小鼠的學習記憶能力。水迷宮的組成成分：一個直徑150 cm，高50 cm，水溫20℃的池子，攝像頭及分析系統。水迷宮的水池水深30 cm，在距水面1.5 cm處放置直徑10 cm的一個逃離平臺。為避免小鼠直接觀察到平臺，可在水中加入白色食用色素混勻使其成為乳白色。水迷宮實驗訓練d 1 4次，d 2和d 3各6次，每次試驗間隔10 min。每次隨機將小鼠從池子的4個不同象限放入水中，由于小鼠天性逃避水環境，當發現平臺后則棲身其上，然后用自動跟蹤系統記錄小鼠發現平臺的潛伏時間，實驗不超過60 s，計算每天的平均潛伏期［13］。

2.8 統計學方法 數據用ˉx±s表示，數據來自3～6次實驗。數據分析使用SPSS 11.5軟件。水迷宮實驗數據使用two-way ANOVA結合LSD檢測。其余數據使用one-way ANOVA結合LSD或者Dunnett′s T3 post-hoc test，進行各組數據間差異分析。

3 結果

3.1 肌肽對r UCCAO誘導的小鼠運動量的作用由Fig 1可知，手術后27 d對小鼠進行運動量檢測發現，在試驗3 min和試驗6 min內，手術組（rUCCAO）小鼠的運動量和假手術組（sham）相比，均沒有差異。肌肽（200，500，750 mg·kg－1）對小鼠的運動量也沒有影響。由于手術及給藥均不影響動物的運動量，因此可以進行后續其他被運動量影響的認知功能實驗。

3.2 肌肽對r UCCAO誘導的小鼠敞箱實驗中探索能力的作用 敞箱實驗用來檢測動物的探索能力，動物在中間區域停留時間越長，說明其探索能力越強。Fig 2結果顯示，在敞箱實驗中，與假手術組相比，手術動物在中間區域停留時間明顯降低（3 min，P＜0.01；6 min，P＜0.01）。肌肽（200，500 mg·kg－1）在3 min和6 min內均能明顯逆轉由手術引起的小鼠在中間區域停留時間的降低（P＜0.05）。

3.3 肌肽對r UCCAO誘導的小鼠疼痛感受的作用由Fig 3結果顯示，與假手術組（sham）相比，手術組（rUCCAO）和給藥組的小鼠在疼痛感受測試中對小鼠的痛閾沒有明顯影響，因此可以進行小鼠恐懼記憶的實驗。

Fig 1 Effect of carnosine（Car）on total distance in locomotor test 3 min（A）and 6 min（B）after r UCCAO（n＝12～14）

3.4 肌肽對r UCCAO誘導的小鼠恐懼記憶的作用為了研究肌肽對于小鼠SIVD后的恐懼條件學習記憶的影響，在腦缺血后的d 29時，對小鼠進行恐懼學習記憶的訓練和測試。實驗結果如Fig 4，在背景記憶實驗中，與假手術組相比，rUCCAO誘導的手術組小鼠恐懼反應明顯降低，而肌肽（200，500 mg·kg－1）明顯提高了小鼠的背景記憶的恐懼反應。但是在線索記憶中，與假手術組相比，手術組和給藥組均不能影響小鼠的線索記憶能力。

3.5 肌肽對r UCCAO誘導的小鼠水迷宮實驗的作用 在水迷宮實驗（Fig 5）中，結果顯示隨著訓練天數的增加，小鼠到達平臺的平均逃避潛伏期逐漸降低。小鼠在rUCCAO誘導后學習記憶的獲得訓練中尋找平臺的潛伏期延長，Two-way ANOVA統計結果顯示，在訓練階段肌肽組明顯優于rUCCAO組（逃避潛伏期：F（1.230）＝27.36，P＜0.01）。其中肌肽（200 mg·kg－1）能明顯縮短學習記憶的獲得訓練中尋找平臺的潛伏期（P＜0.01），而高劑量組肌肽（500 mg·kg－1）僅能縮短水迷宮實驗d 3學習記憶的獲得訓練中尋找平臺的潛伏期（P＜0.05）。

4 討論

Fig 2 Effect of carnosine（Car）on learning and memory in open field test 3 min（A）and 6 min（B）after r UCCAO（n＝12～14）＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05 vs rUCCAO group.

Fig 3 Effect of carnosine（Car）on paw withdrawal threshold in hot plate test after r UCCAO（n＝12～14）

本實驗采用了永久性結扎右側頸總動脈（rUCCAO）的方法來研究肌肽對SIVD的作用［11］。研究發現肌肽能明顯逆轉手術引起的動物認知功能的下降，對SIVD動物的認知功能有明顯的保護作用。

Fig 4 Effect of carnosine（Car）on learning and memory in freezing test after r UCCAO in mice（n＝12～14）

Fig 5 Effect of carnosine（Car）on learning and memory in Morris water maze test after r UCCAO in mice（n＝12～14）

目前實驗室研究SIVD使用的動物模型，常用的有經典大鼠雙側永久性頸總動脈阻塞（2-VO）模型和相應的2-VO改良模型等。但這些模型均存在以下缺點：（1）實驗動物的死亡率高，（2）實驗動物存在明顯的運動系統損傷，學習記憶功能改變不大，（3）由于實驗動物的運動功能障礙明顯，導致其行為學相關指標無法檢測。同時C57BL／6品系小鼠腦內Willis環發育不全，雙側頸總動脈結扎的方法不能在C57BL／6小鼠及相關基因敲除小鼠上制作 SIVD模型［14］。Shibata等［12］利用鋼琴絲制成的微粒，阻塞雙側頸總動脈，能夠誘導學習記憶和白質的損傷，但是此模型導致損傷的嚴重程度與微粒的直徑有關，并且手術操作復雜。近期有報道［11］發現右側頸總動脈永久性結扎（rUCCAO）方法，具有操作簡單、死亡率低、可重復性好、創傷小等優點。在本實驗中我們發現，rUCCAO誘導后對動物的運動量沒有明顯影響，提示手術對實驗動物的運動系統沒有明顯損傷，手術組的實驗動物也不存在明顯的運動功能障礙，可以進行后續的行為學和學習記憶的檢測。

Yoshizaki報道發現，rUCCAO能誘導 C57BL／6小鼠新事物識別實驗中非空間學習記憶的損傷。本實驗結果發現rUCCAO還能夠誘導C57BL／6小鼠恐懼記憶的背景記憶以及和水迷宮實驗中學習記憶能力的下降以及敞箱實驗中動物的探索能力。恐懼記憶實驗能反映動物的恐懼記憶和情緒，水迷宮實驗能反映動物的空間學習記憶，敞箱實驗能反映動物的探索能力。而大腦的胼胝體部位被認為與動物的情緒、空間學習記憶及探索能力有關［15］。因此我們的實驗結果顯示，rUCCAO誘導的慢性缺血會損傷小鼠的空間和非空間學習記憶以及恐懼記憶，能夠更好的模擬臨床SIVD病人的認知功能障礙和白質損傷。實驗還首次發現rUCCAO誘導對動物的疼痛閾值和恐懼記憶實驗中的線索記憶中沒有明顯影響，進一步提示rUCCAO誘導的SIVD能夠特異性損傷白質及其相關腦區。

肌肽被認為是組氨酸的“儲庫”，可以通過肌肽—組氨酸—組胺代謝合成組胺，作用于中樞神經系統的組胺H3受體，減輕大鼠腎缺血／再灌注損傷［6，8］。本研究發現肌肽能夠明顯提高rUCCAO誘導后敞箱實驗中小鼠在中間區域的探索時間。肌肽（200、500 mg·kg－1）對恐懼記憶實驗中小鼠背景記憶能力和水迷宮實驗中小鼠的學習記憶能力有明顯的保護作用，肌肽高劑量750 mg·kg－1對上述學習記憶沒有作用，但是有研究發現肌肽750 mg·kg－1對急性腦缺血引起的動物行為學和神經元損傷有明顯保護作用［10］，本實驗結果提示慢性缺血引起的白質損傷導致的SIVD疾病在發病機制方面和急性的缺血有著明顯的不同，因此在使用藥物治療時應區別急性腦缺血治療藥物的使用方法和劑量。我們的結果顯示低劑量肌肽對SIVD誘導的動物認知功能障礙有明顯的保護，提示肌肽對于治療SIVD存在潛在的臨床價值。

綜上，本實驗首次發現，肌肽對rUCCAO誘導的SIVD動物的認知功能具有明顯的保護作用，結果提示肌肽對于SIVD有著潛在的治療作用。

參考文獻：

［1］ Burns A.Alzheimer′s disease：on the verges of treatment and prevention［J］.Lancet Neurol，2009，8（1）：4－5.

［2］ Kalaria R N，Maestre G E，Arizaga R，et al.Alzheimer′s disease and vascular dementia in developing countries：prevalence，management，and risk factors［J］.Lancet Neurol，2008，7（9）：812－26.

［3］ Olivares D，Deshpande V K，Shi Y，et al.N-Methyl D-Aspartate（NMDA）receptor antagonists and memantine treatment for alzheimer′s disease，vascular dementia and parkinson′s disease［J］.Curr Alzheimer Res，2012，9（6）：746－58.

［4］ Alvarez-Sabin J，Roman G C.Citicoline in vascular cognitive impairment and vascular dementia after stroke［J］.Stroke，2011，（1 Suppl），42：S40－3.

［5］ Pantoni L.Treatment of vascular dementia：evidence from trials with non-cholinergic drugs［J］.JNeurol Sci，2004，226（1－2）：67－70.

［6］ 宋文婷，徐 立，劉建勛.腦缺血后谷氨酸及其受體介導的神經細胞損傷及相關藥物研究進展［J］.中國藥理學通報，2012，28（6）：747－50.

［6］ Song W L，Xu L，Liu J X.Review on pathological mechanism of glutamate and its receptors after cerebral ischemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（6）：747－50.

［7］ Adachi N，Liu K，Arai T.Prevention of brain infarction by postischemic administration of histidine in rats［J］.Brain Res，2005，1039（1－2）：220－3.

［8］ Babizhayev M A，Yegorov Y E.Advanced drug delivery of N-acetylcarnosine（N-acetyl-beta-alanyl-L-histidine），carcinine（betaalanylhistamine）and L-carnosine（beta-alanyl-L-histidine）in targeting peptide compounds as pharmacological chaperones for use in tissue engineering，human disease management and therapy：from in vitro to the clinic［J］.Recent Pat Drug Deliv Formul，2011，4（3）：198－230.

［9］ Kurata H，Fujii T，Tsutsui H，et al.Renoprotective effects of lcarnosine on ischemia／reperfusion-induced renal injury in rats［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319（2）：640－7.

［10］Shen Y，He P，Fan Y Y，et al.Carnosine protects against permanent cerebral ischemia in histidine decarboxylase knockout mice by reducing glutamate excitotoxicity［J］.Free Radic Biol Med，2010，48（5）：727－35.

［11］Yoshizaki K，Adachi K，Kataoka S，et al.Chronic cerebral hypoperfusion induced by right unilateral common carotid artery occlusion causes delayed white matter lesions and cognitive impairment in adult mice［J］.Exper Neurol，2008，210（2）：585－91.

［12］Shibata M，Yamasaki N，Miyakawa T，et al.Selective impairment of working memory in a mouse model of chronic cerebral hypoperfusion［J］.Stroke，2007，38（10）：2826－32.

［13］Morris R.Development of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11（1）：47－60.

［14］Yang G，Kitagawa K，Matsushita K，et al.C57BL／6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains：selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia［J］.Brain Res，1997，752（1－2）：209－18.

［15］Miu A C，Heilman R M，Pasca SP，et al.Behavioral effects of corpus callosum transection and environmental enrichment in adult rats［J］.Behav Brain Res，2006，172（1）：135－44.