基于大鼠原位腸－肝血管灌流模型研究甘草酸的代謝

鐘運鳴，王素軍，曾 潔，黃麗花，程漩格，王桂香，臧林泉

甘草為豆科甘草屬植物甘草（glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖，有“國老”之美譽，是我國臨床上常用的中藥之一。甘草主要含三萜皂苷類和黃酮類。其中三萜皂苷類甘草酸（glycyrrhizin，GZ）含量最高，達6% ～14%，又名甘草甜素或甘草皂苷。近年來藥理和臨床研究發現甘草酸及其衍生物具有抗病毒、抗潰瘍、抗變態反應、抗炎、抗腫瘤、保肝等多種生物活性［1］，引起國內外學者的廣泛關注。但有報道證明甘草酸的口服生物利用度極低（3.04%），且大部分被代謝成甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）而產生高血壓、電解質紊亂和假性醛固酮增多癥等副作用［2－3］。然而，甘草酸在大鼠體內代謝時其腸肝各自發揮的作用，目前國內外尚未見報道。為此，本文首次嘗試采用大鼠原位腸－肝血管灌流模型，觀察甘草酸在大鼠腸道和肝臟中的處置，定量研究了甘草酸的吸收和代謝過程，并評價腸和肝這兩個體內主要代謝器官在甘草酸代謝中的作用，從而為甘草酸的代謝靶點、藥理作用、不良反應及臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和動物 LC-20 AD高效液相色譜儀器（日本島津）；4000Q TRAP串聯四極桿質譜儀（美國 Applied Biosystem公司）；SUPERT21高速冷凍離心機（美國Sorvail公司）；Milli-Q Gradient A10超純水器（美國Millipore公司）；501型超級恒溫箱（上海市實驗儀器廠）；HL-2恒流泵（上海滬西儀器廠）；甘草酸（批號：A0037），甘草次酸（批號：A0038），內標大黃素（批號：110756-200110）均購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純甲醇、色譜純乙酸銨均購自美國Merck公司；其他試劑均為分析純。SPF級S-D大鼠（200～250 g），♀♂各半，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號：scxk（粵）2008-0020。

1.2 實驗方法

1.2.1 灌流液的配制 Krebs-Ringer NaHCO3緩沖液（K-R液）：0.22 g NaH2PO4、7.8 g NaCl、0.37 g CaCl2、0.22 g MgCl2、0.35 g KCl、1.37 g NaHCO3、3.0 g葡萄糖加蒸餾水定容至1 000 ml，調節pH至7.4。內含3%右旋糖酐T-40、5% 牛血清白蛋白、10%洗過的大鼠紅細胞、0.02%地塞米松和0.004%去甲腎上腺素。

1.2.2 樣品處理和LC-MS／MS分析法 樣品分析方法參照文獻稍加改進［4］。樣品處理：取樣品100 μl于1.5 ml EP管中，精密加入濃度為40μg·L－1內標的甲醇－水溶液（V∶V＝1∶1）300μl，渦旋振蕩混勻，離心（14 000 r·min－1，20℃）30 min，取上清10μl進樣分析。液相條件：色譜柱采用 Phenomenex Luna C18柱（2.00 mm×50 mm，5μm），流動相為10 mmol·L－1乙酸銨水溶液－甲醇（V∶V＝95∶5），柱溫25℃，體積流量為 0.2 ml·min－1。質譜檢測條件：采用ESI源負離子模式、多反應檢測（MRM）模式進行測定。檢測離子對分別為 m／z 821.4→351.3（甘草酸）、m／z469.4→425.8（甘草次酸）和 m／z 269→225（大黃素），毛細管電壓4 000 V，干燥氣溫度為330℃，噴霧壓力55 pis，駐留時間0.1 s。

1.3 模型的建立

1.3.1 大鼠原位單向腸－肝血管灌流模型（in situ single pass vascularly perfused rat intestine-liver model，IPIL） 參照我們課題組以前的實驗方法［5－6］，實驗前先用空白灌流液平衡系統15 min后，將含有甘草酸（5 mg·L－1）的灌流液恒定流速（10 ml·min－1）從上腸系膜動脈輸入，經過肝靜脈流出，不形成循環。分別從門靜脈和肝靜脈每隔5 min吸取250μl灌流液置于1.5 ml EP管，持續1 h。膽汁每10 min為一個取樣點，同樣持續1 h。樣品處理后立即進樣分析。實驗手術圖解如Fig 1。

1.3.2 大鼠原位循環腸血管灌流模型（in situ circulated vascularly perfused rat intestine model，IPI）參閱我們課題組以前的模型［5］，灌流液從上腸系膜動脈流入，從門靜脈流出，使得腸血管與導管、儲液池構成一閉合通路，固定插管后將體積流量提高至7.5 ml·min－1，整個實驗過程中用白熾燈加熱控制溫度。實驗前先用空白灌流液平衡15 min并以此作為實驗零點，于十二指腸給予2 mg甘草酸，分別于0、5、15、30、45、60、75、90、105、120min時從儲液池吸取250μl灌流液置于1.5 ml EP管中，在小腸入口和出口處引流收集腸腔液。每次取樣后立即補充同體積的空白灌流液（灌流總體積為100 ml）。樣品處理后立即進樣分析。

Fig 1 Surgical cannulation for in situ vascularly perfused rat intestine-liver model

1.4 數據處理 數據用ˉx±s表示，腸穩態提取率（steady state extraction ratio of the intestine，Ei）和肝穩態提取率（steady state extraction ratio of the liver，Eh）分別用公式（1）和（2）計算；腸清除率（clearance ratio of the intestine，CLi）、肝清除率（clearance ratio of the liver，CLh）和腸肝總清除率（total clearances，CLt）分別用公式（3）、（4）和（5）計算；IPI中以灌流池中目標化合物藥量的對數對取樣時間進行線性回歸，得回歸方程，根據回歸方程的斜率求算吸收速率Ka。

其中CSMA、CHV和CPV分別表示上腸系膜動脈、肝靜脈、門靜脈的穩態藥物濃度，QPV和QHV分別表示門靜脈和肝靜脈的藥物灌流流速。

2 結果

2.1 甘草酸單次通過腸－肝血管灌流模型的動力學過程 單次通過大鼠腸－肝血管灌流后，甘草酸形成的穩態動力學過程如Fig 2。5 mg·L－1的甘草酸以10 ml·min－1流速通過上腸系膜動脈進行灌流。當流出產物形成穩態后（30 min后），甘草酸在灌流液中的變化速率為零。經過腸肝作用后，在肝靜脈流出液和門靜脈流出液中均只檢測到甘草酸而沒有檢測到甘草次酸。在膽管插管收集的膽汁中同樣只檢測到甘草酸，且甘草酸在膽汁中所占的比例較高（Fig 2），在60 min時甘草酸在膽汁中所占比例已達到85%（Fig 3）。灌流液和膽汁中流出的甘草酸均在30 min左右達到穩態。

Fig 2 Disposition of GZ during its single passage through the perfusate rat intestine-liver model（ˉx±s，n＝6）

Fig 3 Cumulative biliary excretion ratio of unchanged GZ excreted in bile（ˉx±s，n＝6）

Tab 1 Metabolic parameters of GZ in the once-through vascularly perfused rat intestine-liver preparation（ˉx±s，n＝6）

2.2 甘草酸大鼠十二指腸給藥后腸血管灌流模型循環灌流的處置過程 樣品處理后經LC-MS／MS測定如Fig 4。上述色譜系統中，無內源性物質干擾灌流液，檢測物色譜行為較佳，甘草酸、甘草次酸和大黃素保留時間分別約為2.74、3.56和3.12 min。甘草酸大鼠十二指腸給藥后及其代謝物甘草次酸在灌流液中的動力學曲線如Fig 5。2 mg甘草酸十二指腸給藥后，0～80 min時甘草酸吸收較快，80 min后開始趨于平穩；120 min時的濃度為（0.42±0.06）mg·L－1，經計算得出甘草酸吸收量為2.01%（120 min時灌流液中甘草酸含量與腸道給藥量的比值）。代謝產物甘草次酸在灌流5 min后能檢測到，甘草次酸20～80 min上升較快，120 min時濃度為（8.45±0.76）mg·L－1。

由于甘草酸在循環灌流系統中僅僅通過代謝而消除，甘草酸和其代謝產物均未離開系統。儲液池中甘草酸及其產物的濃度－時間動力學曲線具有靜注單室模型和血管外途徑單室模型的動力學特征，故我們選用藥動學計算軟件（3P97）對甘草酸和產物甘草次酸的消長動力學過程進行擬合，曲線的實測值與擬合值間有良好的相關性（R＞0.9），由此得到的主要藥動學參數（Tab 2）。

Tab 2 Kinetic parameters of GZ and its metabolite（GA）in the intestinal perfusion（ˉx±s，n＝6）

Fig 4 LC-MS／MSchromatograms of perfusion samples

3 討論

大鼠原位腸－肝血管灌流模型具有諸多優點，如保持了實驗中腸肝的完整性，同時避免了藥物的廣泛分布、可分析各種外加因素對藥物代謝的影響、將腸灌流和肝灌流結合一起，不僅可以評價腸肝的共同作用亦可評價各自作用亦可研究腸道菌群和酶對藥物代謝的影響。因而這一模型在藥物的首過效應、吸收和代謝等研究中具有廣闊的應用前景。

Fig 5 Disposition of GZ during its recirculating intestinal perfusion after intraduodenal administration（ˉx±s，n＝6）

本文在前期工作［5－6］的基礎上利用該模型研究甘草酸在大鼠體內的代謝，并評估了腸肝在甘草酸代謝中的作用。在單向腸－肝血管灌流實驗中，甘草酸的穩態肝提取率（28.0±3.0）%，是穩態腸提取率（4.2±0.6）%的7倍，且在肝靜脈流出液和門靜脈流出液均只檢測到甘草酸的存在，這些表明上腸系膜動脈給予甘草酸后，甘草酸未在肝臟中被代謝。由于甘草酸在肝臟中不是被代謝成甘草次酸，所以甘草酸的肝首過消除不是造成其生物利用度低的主要原因，而是因為腸道菌群對其的大量代謝。同時收集的膽汁中我們檢測到大量的甘草酸，1 h后甘草酸在膽汁中所占比例已達到85%（Fig 3），說明從門靜脈進入的甘草酸很大一部分被分泌到膽汁中。從而佐證了甘草酸從門靜脈注射給藥后很難在系統靜脈血中檢測到甘草次酸［7－8］。在循環腸血管灌流中，十二指腸給予2 mg甘草酸后，通過檢測儲液池中的灌流液中發現甘草酸與甘草次酸同時存在（Fig 4），計算得出甘草酸的一級吸收速率常數和消除半衰期β分別為（0.33±0.06）min－1和（2.40±0.31）min。有研究表明［9］甘草次酸的一級吸收速率常數在（1.53～1.87）min－1間且甘草次酸的表觀滲透系數是甘草酸的10倍以上。上述腸血管灌流實驗中甘草酸的吸收速率常數小于甘草次酸吸收速率常數參考值，而且灌流120 min后，甘草酸的吸收量僅為2.01%，表明甘草酸在腸道吸收差代謝快，大部分轉變為甘草次酸。通過檢測腸腔液體，發現存在大量甘草次酸，進一步說明甘草酸在腸道菌群或腸道酶存在下被大量代謝為甘草次酸，這結果與文獻相符合［10－11］。

綜上所述，原位腸－肝血管灌流模型揭示了口服甘草酸后，甘草酸很難被吸收而且主要在腸道中被菌群或酶代謝。同時原位腸－肝灌血管流模型在研究藥動學方面具有很大的潛力和廣闊的應用前景。不僅可以評價機體對藥物的首過效應，還可以了解腸道、肝臟在這一過程中的作用及各自的貢獻度。

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