四氫生物蝶呤在2型糖尿病腎病小鼠腎臟NO生成中的作用

汪建云，王棟棟，陸昭磊，朱 闖，張 帆，郭 昊，印曉星

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是導致終末期腎病的常見病因之一，嚴重影響了糖尿病患者的生活質量。在DN的發生發展過程中，一氧化氮（nitric oxide，NO）發揮著重要的作用，直接參與了糖尿病早期腎小球高灌注和高濾過的形成，造成DN的多尿與蛋白尿［1－2］。我們前期的實驗發現，高糖培養的腎小球系膜細胞誘導型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）活性明顯增高，進而引起NO增高［3］。四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）為NO合成的關鍵酶iNOS的必要輔因子，NO的生成與BH4的水平有著密切的聯系。目前有關糖尿病腎病中BH4與NO及尿量、蛋白尿關系的研究，鮮見報道。

本研究采用BH4合成酶－Ⅰ型三磷酸鳥苷環化水解酶（guanosine triphosphate cyclohydrolase I，GTPCHⅠ）的抑制劑 2，4二氨基 6羥基嘧啶（DAHP），在國際上廣為采用的先天性2型糖尿病所致的腎病模型（2型DN）db／db小鼠上，觀察BH4對iNOS的蛋白表達、NO生成及血尿生化指標的影響，為2型DN的防治尋找新的靶點提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 尿蛋白檢測試劑盒、NOS活性檢測試劑盒及血肌酐（Scr）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，總NO試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所，葡萄糖測定試劑購自上海榮盛生物藥業有限公司。DAHP購自Sigma公司，兔多克隆抗iNOS抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處置 12周齡自發性糖尿病C57BL／KSJdb／db小鼠及同周齡非糖尿病C57／KSJ db／m小鼠，由南京軍區總醫院從美國Jackson公司引進，自體繁殖成功后提供。收集小鼠24 h尿液，檢測24 h尿蛋白，證實小鼠發生DN（db／db小鼠24 h尿蛋白含量明顯高于db／m小鼠）。將成模的DN小鼠隨機分為2組：DAHP治療組（DAHP組，n＝8），腹腔注射 DAHP150 mg·kg－1（溶于 5%DMSO生理鹽水中）；糖尿病腎病組（DN組，n＝6），腹腔注射相同劑量的5%DMSO生理鹽水。同周齡db／km小鼠為正常對照組（NS組，n＝6），腹腔注射相同劑量的5%DMSO生理鹽水。所用的動物實驗按照徐州醫學院倫理委員會準則操作。3組小鼠給藥7 d，收集血液及24 h尿液，處死。迅速分離兩側腎臟，生理鹽水沖洗后稱重，去除髓質。取部分腎皮質以福爾馬林固定，作iNOS的免疫組化測定。其余腎皮質置于－80℃冰箱內，備BH4、NO及iNOS蛋白的檢測。

1.2.2 常規血尿生化指標測定 血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測；用代謝籠收集小鼠24 h尿量，24 h尿蛋白測定采用考馬斯亮藍法檢測；血肌酐采用苦味酸法檢測。所有指標均在Elx808IU酶標儀上檢測（美國Bio-tex公司）。

1.2.3 Griess法檢測腎皮質NO 將50 mg腎皮質用200μl的PBS勻漿處理，離心。根據Griess反應原理，取100μl離心液加入等量的Griess反應液，混勻，室溫放置10 min，用酶標儀于540 nm處進行光密度測定，根據標準曲線換算NO濃度。

1.2.4 比色法檢測腎皮質iNOS活性 將50 mg腎皮質用200μl的PBS勻漿處理，離心，取上清液。iNOS的活性不依賴鈣，可催化L-精氨酸和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質生成有色化合物，在530 nm波長處測定其光密度值，即代表iNOS活性。具體操作參照NOS活性檢測試劑盒說明進行。

1.2.5 免疫組化法檢測iNOS蛋白 大鼠腎臟以10%中性福爾馬林固定24 h后，石蠟包埋切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237℃孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶，0.01 mol·L－1枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸15 min，以修復抗原，正常山羊血清工作液封閉2 h，滴加兔多克隆抗iNOS抗體（1∶200），4℃ 冰箱孵育過夜，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗，DAB顯色。

1.2.6 Western blot法測iNOS蛋白 取預處理的腎皮質細胞在冷提液中勻漿。以BCA法測定總蛋白濃度。取上樣蛋白100μg，經8%的SDS-PAGE電轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加兔多克隆抗iNOS抗體（1∶200），4℃過夜；TBST緩沖液洗膜后，加堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）孵育2 h。滴加 BCIP／NBT顯色液，避光顯色15 min。以β-actin為內參，iNOS與β-actin的灰度比值代表iNOS的相對表達量。

1.2.7 HPLC法檢測BH4將腎皮質組織在裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol·L－1DTT，1 mmol·L－1EDTA）中勻漿、離心。取上清，BCA試劑盒檢測蛋白含量。在上清中按照90μl裂解液中加入10μl 1.5 mol·L－1HClO4和2.0 mol·L－1H3PO4（1∶1）的比例處理析出蛋白，取上清分兩部分處理。一部分在酸性條件下氧化：按90μl裂解液中加10μl 1% 碘液（2%KI配制）比例混勻，避光置于室溫60 min，加入5μl新配制的抗壞血酸溶液（20 g·L－1），離心；一部分于堿性條件下氧化：按80μl裂解液中加入10μl NaOH，再加入10 μl碘液的比例混勻，避光置于室溫60 min；加入20 μl H3PO4及5μl抗壞血酸溶液，離心。取兩者的上清采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm柱）反相高效液相色譜法分析（Shimadzu LC.10A高效液相色譜儀，日本島津）。以甲醇／水混合液（5% ∶95%）作為流動相，1.0 ml·min－1恒速洗脫。通過熒光檢測器（RF-10Ax）在熒光激發波長350 nm、發射波長450 nm處檢測生物蝶呤的積分峰面積值，出峰時間6.0 min左右。該方法檢測生物蝶呤靈敏度為152 ng·L－1。在酸性條件下氧化的標本檢測出總生物蝶呤（biopterin）包括BH4、二氫生物喋呤和生物喋呤；在堿性條件下氧化的標本檢測出二氫生物喋呤和生物喋呤；將二氫生物喋呤和生物喋呤從總生物蝶呤中除去，就是BH4含量。

1.3 統計學分析 數據均以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0統計軟件處理。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果

2.1 小鼠各項生化指標 DN組及DAHP組小鼠血糖、24 h尿蛋白、24 h尿量、Scr明顯高于NS組（P＜0.05），表明db／db小鼠此時已進入DN階段，DN模型建模成功。與DN組比較，DAHP組體重、24 h尿蛋白及尿量明顯低于DN組（P＜0.05），而Scr及血糖無明顯降低（Tab 1）。

Tab 1 Biochemical characteristics of mice（ˉx±s）

2.2 各組小鼠腎皮質中BH4水平 DN組的BH4水平明顯高于 NS組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明糖尿病腎病時腎皮質中BH4水平增高；BH4合成酶抑制劑DAHP組的BH4水平明顯低于DN組（P＜0.01），表明DAHP能明顯抑制糖尿病腎病時BH4的合成（Fig 1）。

Fig 1 BH 4 levels in renal cortex of mice

2.3 小鼠腎皮質中iNOS蛋白表達 免疫組化法顯示：腎小球iNOS蛋白位于腎細胞胞質中。NS組腎皮質中iNOS蛋白鮮有表達，DN腎病中iNOS蛋白染色密度較NS組明顯加深，經過DAHP治療后，DN小鼠的腎皮質中iNOS蛋白染色密度降低。Western blot結果顯示：DN組的iNOS蛋白水平明顯高于NS組，差異有統計學意義（P＜0.01），DAHP組的iNOS水平明顯低于DN組（P＜0.05）（Fig 2）。表明DN小鼠腎皮質中iNOS蛋白表達增高；當BH4合成被抑制后，iNOS蛋白表達明顯降低，即DN小鼠腎皮質iNOS的蛋白表達受BH4的調控。

2.4 小鼠腎皮質中iNOS活性 DN組小鼠腎皮質中iNOS活性明顯高于NS組小鼠（P＜0.05）；DAHP組iNOS活性明顯低于 DN組（P＜0.01）（Fig 3）。表明DN小鼠腎皮質中iNOS活性明顯增高，當BH4合成被抑制后，其活性明顯降低。

Fig 2 Expression of iNOS protein in renal cortex of mice

Fig 3 Activity of iNOS in renal cortex of mice

2.5 小鼠腎皮質中NO水平 DN組NO水平明顯高于NS組，差異有統計學意義（P＜0.05），DAHP組的NO水平明顯低于DN組（P＜0.05）（Fig 4）。表明DN小鼠腎皮質中NO水平明顯增高；當BH4合成被抑制后，NO生成減少。

Fig 4 NO level in renal cortex of mice

3 討論

糖尿病已經成為全球流行疾病，其中2型糖尿病占糖尿病總體人群的95%以上［4］。DN是2型糖尿病最常見的并發癥，也是2型糖尿病患者的主要死亡原因之一。2型DN的發病機制非常復雜，至今尚未完全闡明。研究表明，長期的高血糖所致的細胞因子的表達失衡、氧化應激以及由此引起的腎臟血流動力學異常在2型DN病程中起著非常重要的作用。

NO是一種重要的生理、病理性因子，它可擴張血管，改變腎血流量、增加腎小球濾過率。目前國內外學者對NO在DN中的利弊作用說法不一［5－8］。但是有大量研究表明，NO的過量生成是DN腎小球高內壓、高灌注、高濾過的主要原因，直接促進蛋白尿的產生，降低異常增高的NO的生成可有效減少尿蛋白的生成［7－8］。本研究也發現，DN小鼠腎皮質中NO水平明顯增高，24 h尿量及尿蛋白也明顯增加。因此有效降低NO很可能是防治DN腎損害的新的切入點。

NO由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸而產生。NOS可分為兩大類，一類是構成型一氧化氮合酶（constitutive NOS，cNOS），包括內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）和神經元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS），其產生的基礎NO主要參與正常的細胞內信號傳遞；另一類是誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），只在細胞受到病理性刺激如微生物內外毒素、氧化應激、炎癥介質（TNF-α、IL-1）等的傷害后才表達［9］。且 iNOS一旦表達，其活性將持續數小時，產生的NO是eNOS和nNOS的100～1 000倍。此時，異常增高的NO可造成組織損傷［10］。大量研究證實，DN腎皮質中eNOS蛋白表達明顯降低［11－12］。以 eNOS基因缺陷引起的eNOS表達降低已成為目前DN動物模型之一［13－15］。而nNOS通常表達于神經組織中，在腎皮質中表達較少。因此，DN中異常增高的NO可能由iNOS的改變引起。為此，本研究檢測了iNOS的蛋白表達及酶活性。結果顯示：DN腎皮質中iNOS蛋白表達及酶活性明顯增高，這可能是導致DN腎皮質中NO異常增高的主要原因。

BH4作為NO合成的關鍵酶iNOS的必要輔因子，具有穩定iNOS結構、增加L-精氨酸和iNOS結合力等作用。目前有關BH4的研究多數關注于其缺陷造成的內皮功能障礙，它的缺乏可產生多種疾病［16－18］。但是近年來有學者表明，BH4的異常增高可引起線粒體功能障礙，從而造成活性氧的惡性循環，組織損害作用更強［19］。很多疾病如白癜風、惡性貧血、神經退行性疾病等與BH4的異常增高密切相關［19－21］。在本研究中，我們發現2型DN小鼠腎皮質中BH4水平明顯增高，iNOS表達明顯增強。當采用GTPCHI（BH4合成的限速酶）抑制劑阻斷BH4合成后，2型DN小鼠腎臟中iNOS及NO含量明顯降低，這表明DN腎皮質中增高的BH4可能是造成iNOS表達增強的主要原因。因此，有效保持BH4平衡對機體微環境的維持是非常重要的。減少2型DN腎皮質中BH4的量可有效降低iNOS及NO的水平，進而降低尿量及尿蛋白。同時我們發現DAHP組體重較DN組明顯下降，表明抑制BH4的合成可對2型DN的升高的體重有所改善。但是DAHP對血糖、肌酐沒有影響，這將值得我們進一步探索其機制。

綜上，在自發性2型DN小鼠腎臟中，BH4含量明顯增加，進而可使iNOS蛋白表達及酶活性增加，從而導致NO生成增多，這與2型DN的多尿及蛋白尿密切相關。因此，BH4很可能是防治2型DN的治療靶點之一，這值得我們進一步深入研究。

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