淫羊藿苷通過降低醛固酮水平減輕自發性高血壓大鼠腎間質纖維化

李葉麗，王穎婉，李意奇，張麗梅，龔其海，楊丹莉

高血壓腎損害系由原發性或繼發性高血壓引起的腎臟疾病，其中腎間質纖維化是導致腎臟損傷的重要原因。醛固酮作為腎間質纖維化進程中的一個重要因素，已成為高血壓腎損害研究的熱點之一。最近研究表明，醛固酮可上調離體的腎小管上皮細胞促纖維化的細胞因子如Ⅲ型膠原、TGF-β1、CTGF、FN等的表達［1－4］，加速腎間質纖維化的發生與發展。淫羊藿為小檗科淫羊屬植物，具有溫陽補腎、除風祛濕、強心益氣等功效。ICA是淫羊藿的主要活性成分，現代藥理學研究證明，ICA具有抗腫瘤、增強免疫、改善心腦血管功能、調節內分泌及抗骨質疏松等作用［5］。本研究擬觀察 ICA是否具有抗SHR腎間質纖維化作用，及該效應是否與降低醛固酮水平，下調TGF-β1和Smad2的表達有關。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 淫羊藿苷購自南京澤朗醫藥有限公司；醛固酮試劑盒和Ⅲ型膠原試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；RNA逆轉錄試劑盒、熒光混合物，β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN的引物購自TaKaRa生物工程公司；RNA逆轉錄儀，德國Eppendorf公司；real time RT-PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；通用酶標儀，美國 BIO-RAD公司；Leica光學顯微鏡及照相系統，德國Leica Microsystems Ltd。

1.2 實驗動物及分組 13周齡的♂ SHR大鼠14只、WKY大鼠7只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001。SHR大鼠隨機分為兩組，分別為模型組（n＝7）和ICA組（n＝7），WKY大鼠作為對照組。所有大鼠適應性飼養1周后，ICA組給予 ICA 40 mg·kg－1，ig，bid，至26周齡，模型組和對照組給予等量生理鹽水。

1.3 腎臟病理學 給藥14周后，7%水合氯醛（0.35 g·kg－1）經腹腔注射麻醉成功后，取各組大鼠腎臟組織，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，分別進行HE和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理學變化。

1.4 血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量測定 腹主動脈取血2 ml，置于抗凝管中，離心后取上清，采用雙抗體夾心法測定血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量。測定方法嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.5 real time RT-PCR法檢測腎臟組織中TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達 取各組腎臟組織，置于1 ml TRIzol中，提取總RNA并檢測其純度后，經兩步法逆轉錄－聚合酶鏈反應分別檢測β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達。相關引物參照 GenBank中大鼠 β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的序列設計，見 Tab 1。目的基因表達相對定量法：以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需的循環數（cycle threshold，Ct值）為統計參數，依次計算平均 Ct值 ＝（Ct1＋Ct2）／2（重復管）；dCt＝平均 Ct值 －中間值；基因表達 ＝2－dCt；相對定量 ＝目的基因的表達／內參基因的表達×100，將空白對照組的mRNA表達量設定為100。

1.6 統計學分析 所有數據均采用SPSS 11.0統計分析軟件進行處理，以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，SNK法兩兩比較。

2 結果

2.1 腎臟病理學 HE和Masson染色均顯示對照組腎小球、腎小管結構正常。與正常對照組比較，HE染色結果顯示模型組腎小球囊腔狹窄且不規則，小球內系膜基質增多，細胞排列紊亂，Masson染色結果顯示腎小管纖維增生，間質纖維化；與模型組比較，HE和Masson染色顯示ICA組腎小球囊腔增寬，小球內系膜基質減少，細胞排列較為整齊，腎小管間質纖維化程度減輕，見Fig 1。

2.2 血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量 與正常對照組比較，模型組血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量均升高（P＜0.01）；與模型組比較，ICA組血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量均降低（P＜0.01或 P＜0.05），結果見Tab 2。

Tab 1 Primer pair of real time RT-PCR

Tab 2 Effects of ICA on plasma aldosterone and collagen typeⅢ（ˉx±s，n＝6）

2.3 腎臟組織中 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達 與正常對照組比較，模型組TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達均明顯上調（P＜0.01或 P＜0.05）；與模型組比較，ICA組 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達均明顯下調（P＜0.01或P＜0.05），結果見Fig 2。

3 討論

腎間質纖維化是腎臟疾病發展和預后的重要因素，也是導致腎單位進行性損傷的病理機制，其本質是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）異常沉積，ECM過度合成和降解受抑是ECM積聚的直接原因［6］。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組腎小球囊腔狹窄且不規則，腎小球內系膜基質增多，腎小管間質纖維化，提示模型組大鼠出現了明顯的腎間質纖維化。另有研究表明［7］，24周齡的自發性高血壓大鼠出現了明顯的腎間質纖維化。

Fig 1 HE staining of kidney tissue（×400）and Masson staining of kidney tissue（×200）

Fig 2 Effects of ICA on expressions of TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA in kidney tissue（ˉx±s，n＝6）

醛固酮可促進腎間質纖維化的發生［8－9］，也可上調Ⅲ型膠原、TGF-β1、CTGF、FN等的表達［1－4］。最近研究表明，醛固酮可能通過調控基質金屬蛋白酶1／金屬蛋白酶1組織抑制劑（MMP-1／TIMP-1）的基因表達，使Ⅲ型膠原降解減少，ECM過度積聚［3］；也可能通過促進 TGF-β1的表達誘導CTGF的表達［10］，從而促進腎間質纖維化的發展。

TGF-β1是一種重要的促纖維化細胞因子，可參與成纖維細胞的增殖、分化與遷移，促進ECM的生成與沉積，抑制其降解［11］。TGF-β1／Smad2信號通路的過度激活，可導致腎臟ECM生成增多，直接或間接導致CTGF和FN的產生［12］。CTGF作為TGF-β1的下游，可促使TGF-β1發揮促增生和ECM合成等作用［13］，也可在 TGF-β1誘導下參與成纖維細胞合成FN，使ECM在腎間質積聚，促進腎間質纖維化的發展。

與模型組相比，ICA組腎小球囊腔增寬，腎小球內系膜基質減少，細胞排列較為整齊，腎小管間質纖維化程度減輕，提示ICA可能具有抗SHR腎間質纖維化的作用。此外，ICA組血漿醛固酮、Ⅲ型膠原含量，以及 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達均明顯低于模型組，提示ICA可能通過降低醛固酮水平，下調TGF-β1和Smad2的表達抗SHR腎間質纖維化。

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