香煙提取物對血栓調節蛋白與凝血酶結合力的影響

魏玉杰，劉惠亮，李 屹，張 蛟，徐 麗，張雪潔

研究表明［1］，吸煙是心血管疾病的獨立危險因素，它可致凝血功能異常，血栓形成。但是，目前吸煙導致血管內血栓形成的機制仍不明確。血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）是內皮細胞表面一種強的抗凝活性糖蛋白，它和凝血酶1∶1結合導致凝血酶底物發生特異性改變，從而起到抗血栓作用。TM與凝血酶結合，不但受TM量表達的影響，同時也受其與凝血酶在單分子間相互作用的影響。關于生物分子間相互作用的研究，原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）具有獨特的優勢，因為它可以測定活細胞表面單分子間相互作用力。在活細胞表面直接測定單對生物分子（如膜蛋白受體／配體）的相互作用力，可以更真實地反映生理條件下生物分子間的相互作用性質［2］。近年來關于活細胞表面單分子力譜測量的研究開展逐漸增多，但是關于TM與凝血酶單分子間相互作用的研究目前尚未見報道，而吸煙是否會影響二者間在單分子水平的結合尚不清楚。

本研究采用5%香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）孵育經轉染 TM-GFP質粒的 COS-7細胞，利用AFM單分子力譜法檢測凝血酶與TM在單分子水平的相互作用，從而探討吸煙致血管內血栓形成的可能機制。

1 材料

1.1 實驗細胞 培養的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）從人臍帶的臍靜脈中分離獲得。實驗用第2～3代細胞。非洲綠猴腎成纖維細胞COS-7由軍事醫學科學院八所提供。

1.2 試劑 （1）CSE：取紅梅牌香煙（含焦油12 mg／支，煙氣煙堿量1.1 mg／支，煙氣一氧化碳量13 mg／支）自制。（2）質粒小提試劑盒購自Promega公司，BamHI、HindIII限制性核酸內切酶及購自TaKa-Ra公司，鼠抗人TM單克隆抗體購自英國Abcam公司，實驗用凝血酶粉劑購自美國Sigma公司，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、Medium 200培養基、MEM培養基均購自美國Gibco公司，無水乙醇、氫氟酸、丙酮、二甲基亞砜等購自北京化學試劑公司。

1.3 主要儀器 原子力顯微鏡：美國PicoSPM公司。AFM探針：上海愛建納米科技有限公司。PCR儀：德國 Biometra公司。熒光倒置顯微鏡：Olympus公司。激光共聚焦顯微鏡：UltraView PerkinElmer公司等。

2 方法

2.1 人臍靜脈內皮細胞原代培養 按照郭卿等［3］方法，取剖宮產后新鮮臍帶（武警總醫院婦產科提供）應用0.1%Ⅰ型膠原酶消化得到HUVEC原代，細胞（80～90）%融合時傳代；實驗用第2～3代。

2.2 參照 Nakamura［4］方法制備 CSE 兩支去過濾嘴香煙于一個注射器驅動裝置連續點燃。注射器經三通裝置連續抽吸，吸入的煙霧經三通的另一個出口通入50 ml PBS溶液制成懸液，1 mol·L－1NaOH調制pH值至7.4，用0.22μm的微孔濾器過濾除去細菌和大顆粒物質30 min內用于實驗。

2.3 重組質粒pTM-GFP的構建及轉染COS-7細胞 從HUVEC中提取總RNA反轉錄后得到TM的cDNA片段，通過RT-PCR擴增目的片段TM（1700 bp），設計上游引物包含HindⅢ酶切位點：5′-CGA AGC TTA TGC TTG GGG TCC TGG TC-3′；下游引物包含BamHⅠ酶切位點：5′-ATGGAT CCGAGT CTC TGC GGC GTC GC-3′（由寶生物工程大連有限公司合成上述引物；人TM全長cDNA序列于NCBI基因庫檢索獲得，NM＿000361.2）。將目的基因與載體連接轉化、雙酶切鑒定，提取獲得重組質粒pTM-GFP，轉染至COS-7細胞，37℃、5%CO2的條件下培養6 h后更換完全培養基（10%FBS和青霉素、鏈霉素各100 kU·L－1的MEM培養液），轉染24 h內用于實驗。

2.4 利用AFM測定TM與凝血酶的相互作用

2.4.1 AFM探針的修飾（參照 Yang等［5］方法）將AFM探針置于 Plasma（PDC-32G-2，Harrick Scientific Corp，NY）反應器中，在1mbar的高純氧氣氛中最高功率條件下反應120 s，在甲苯溶液中（含1%3-巰基丙基三甲氧基硅烷，V／V）室溫下孵育1 h，再以丙酮、無水乙醇、雙蒸水沖洗，氮氣吹干，浸入1 g·L－1N-羥基琥珀酰亞胺－聚乙烯乙二醇－馬來酰亞胺（DMSO）液中2 h，將針尖浸入凝血酶蛋白溶液中（2 mg·L－1）室溫下反應0.5 h，固定好蛋白樣品針尖4℃保存，1周內用于實驗。

2.4.2 功能化硅片制備 參照文獻［6－7］，取 1 cm×1 cm單晶體硅片在室溫下浸入堿性溶液（NH4OH∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5，V／V）清洗表面30 min；在 piranha溶液 （98%H2SO4∶H2O2＝7∶3，V／V）中加熱到90℃保溫30 min以獲得清潔和羥基化的硅片表面。將洗凈的硅片轉移至含1.0%APTES的甲苯溶液中，在室溫下反應2 h后，用甲苯反復沖洗硅片表面，以除去表面沒有反應的硅烷化試劑；并依次用丙酮、乙醇清洗，氮氣吹干，硅烷化的硅片轉移至0.1%的戊二醛溶液中 （選用PBS緩沖溶液：10 mmol·L－1Na2HPO4，1.8 mmol·L－1KH2PO4，2.7 mmol· L－1KCl，140 mmol· L－1NaCl，pH 7.4），室溫下反應0.5 h，然后用 PBS緩沖溶液沖洗。經過戊二醛活化后的硅片浸入到TM-ECD蛋白溶液中 （1 mg·L－1緩沖溶液中），室溫放置3 h。處理后用緩沖溶液清洗，在4℃下緩沖液中保存待用。

2.4.3 單分子力譜測定TM與凝血酶相互作用力

2.4.3.1 活細胞表面實驗分組 ①空白質粒對照組（GFP-thr group）；② TM-GFP對照組（TM-thr group）；③5%CSE孵育TM-GFP細胞1 h組（CSETM-thr group）；④ 5%CSE孵育空白質粒細胞組（CSE-GFP-thr group）；每組測力后均加入鼠抗人特異單克隆抗TM抗體（2 mg·L－1封閉30 min）行封閉阻斷實驗。

2.4.3.2 硅片表面實驗分組 ① TM-凝血酶對照組（TM-Thr-SGroup）；② 5%CSE孵育硅片1 h組（CSE-TM-thr-Sgroup）；每組測力后均行封閉阻斷實驗。

2.4.3.3 原子力顯微鏡測力 采用AFM及倒置熒光顯微鏡的聯用系統，在AFM的接觸模式下，針尖反復在COS-7細胞表面或TM-ECD修飾的硅片表面下壓－回拉，隨機獲得力－距離曲線，用同一個針尖在6～10個細胞表面（每組實驗條件下）進行測力，每個細胞隨機選取4～6個位置共記錄1 000條力－距離曲線，所得力 －距曲線采用 MATLAB R2009a軟件分析。分析所得黏附力值，進行統計學處理，求出力的高斯分布。同時，可以求得在所有曲線中發生特異性黏附的成鍵幾率。

2.5 統計學方法 采用Origin 7.0和SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料以ˉx±s表示，各組間結合幾率比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；阻斷前后比較采用配對t檢驗。

3 結果

3.1 TM與凝血酶在細胞表面的相互作用 TM與凝血酶（TM-thr group）在細胞表面單分子水平相互作用力的大小為（60.90±0.82）皮牛（pN）（Fig 1），成鍵幾率為（22.58±3.95）%；抗體阻斷后成鍵幾率為（2.58±2.0）%較阻斷前明顯降低，P＜0.05。

3.2 四組間成鍵幾率比較 GFP-Thr group成鍵幾率在抗體阻斷前后分別為（3.74±3.42）%，（2.52±0.51）%；CSE-TM-Thr group為（6.30±4.20）%，（2.70±2.19）%；CSE-GFP-Thr group為（4.40±1.48）%，（1.12±1.06）%。3組與 TM-Thr group比較，P＜0.05；但3組間兩兩比較差異無統計學意義。每組經抗體阻斷成鍵幾率雖有降低，但是阻斷前后無統計學差異（Fig 2）。

3.3 5%CSE孵育前后TM與凝血酶在硅片表面的相互作用 TM與凝血酶在硅片表面單分子水平相互作用力的大小為（45.30±1.37）pN，成鍵幾率為（23.25±7.02）%；抗體阻斷后成鍵幾率為（4.64±2.31）%，較阻斷前明顯降低，P＜0.05。5%CSE孵育硅片1 h后TM與凝血酶的成鍵幾率為（8.31±1.06）%，與TM-Thr-S組比較，P＜0.05，特異抗體封閉后成鍵幾率為（5.17±2.96）%，見Fig 3。

Fig 1 Histogram of the binding forces of TM／Thr

Fig 2 Single-molecule binding probabilities of TM／Thr obtained by thrombin modified AFM tips in different experiments

4 討論

TM主要分布于內皮細胞，在平滑肌細胞，單核細胞、白細胞、角蛋白細胞及一些腫瘤細胞也有少量表達［9－10］，而非洲綠猴腎成纖維細胞COS-7未見報道有TM表達。因此本研究把成功構建的TM-GFP質粒轉染至COS-7細胞，可以起到兩方面的作用：一方面可使AFM掃描時達到可視化；另一方面可排除由于掃描細胞本身存在TM的表達會干擾AFM檢測凝血酶與TM之間的作用力。TM有5個功能區，其中在第2個功能區類表皮生長因子結構區有6個重復序列，5和6區是凝血酶結合部位［11］。當TM與凝血酶在結合相互作用發生改變會影響到TM的抗凝作用。本研究利用表位在類表皮生長因子5區特異性單克隆鼠抗人TM抗體進行封閉，這個部位恰恰是TM與凝血酶的結合部位，研究結果顯示每組阻斷實驗阻斷后的結合幾率均明顯減少（除GFP-Thr組變化不明顯外），表明抗體封閉阻斷特異且效果比較好。而GFP-Thr組沒有變化，提示空白質粒轉染的細胞沒有TM和凝血酶特異性結合。

Fig 3 Single-molecule binding probabilities of TM／Thr-S obtained by thrombin modified AFM tips in different experiments

由于AFM可以在活細胞上直接檢測單對生物分子如膜蛋白受體／配體的相互作用力，被廣泛應用于生物研究領域。它的工作模式主要有接觸模式和輕敲模式。輕敲模式也就是探針水平掃描可以獲得高分辨率成像，本課題組前期利用此模式清晰地觀察到兔動脈粥樣硬化不同時期血管內皮的超微結構變化［12］。接觸模式也就是探針豎直掃描可檢測到單分子間相互作用力，本研究采用接觸模式可使針尖在樣品表面豎直方向上下運動，系統記錄在針尖反復下壓－接觸－提拉的循環過程中微懸臂彎曲方向和程度的改變，并將此變化轉化為分子間相互作用的力值，即為針尖固有的彈性常數與形變程度的乘積，此作用力值可精確到皮牛級。Lee等［13］利用AFM皮牛級的測力靈敏度來研究生物分子間的非共價作用，為在單分子水平上分子間相互作用力的測定奠定了基礎。本研究采用AFM測得凝血酶與TM之間的相互作用力約為60pN，從高斯擬合的結合力分布圖顯示為單峰圖譜；TM與凝血酶的AFM成鍵幾率為（22.58±3.95）%，而利用特異抗體阻斷后成鍵幾率明顯減低；并且有文獻報道［5］，成鍵幾率在（10～30）%時認為所得力值為單分子間作用力，綜合以上3點提示60pN是凝血酶與TM之間特異性的結合力。

本研究結果顯示，在COS-7細胞表面：與TMThr對照組比較，5%CSE孵育1 h后，TM與凝血酶結合幾率明顯降低。同樣，在等量TM修飾的硅片表面：與TM-Thr-S對照組比較，5%CSE孵育1 h后TM與凝血酶結合幾率也是明顯減少的。表明CSE明顯影響了TM與凝血酶在單分子水平的結合，降低兩者之間的結合幾率，并不是通過影響TM量的表達來實現的。TM與凝血酶結合幾率降低，從而使得抗凝系統減弱，血栓形成風險增加。關于CSE減少TM與凝血酶結合的機制是通過類似抗體封閉的方式阻斷了兩者的相互結合，還是通過改變TM的分子構象，這有待于進一步研究證實。

以上結果表明，CSE有可能是通過降低了TM與凝血酶在單分子水平的結合幾率，降低抗凝系統功能，從而導致血管內血栓形成風險增加。

參考文獻：

［1］ Rabinovitch N，Strand M，Stuhlman K，Gelfand E W.Exposure to tobacco smoke increases leukotriene E4-related albuterol usage andresponse to montelukast［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（6）：1365－71.

［2］ 徐永春，師曉麗，方曉紅.原子力顯微鏡單分子力譜研究生物分子間相互作用［J］.生命科學，2008，20（1）：39－45.

［2］ Xu Y C，Shi X L，Fang X H.Biomolecular interaction study by atomic force microscopy single-molecule force spectroscopy［J］.Chin Bull Life Sci，2008，20（1）：39－45.

［3］ 郭 卿，劉惠亮，董 敏.氧化型低密度脂蛋白對人臍靜脈內皮細胞功能及膜表面超微結構的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19（1）：34－8.

［3］ Guo Q，Liu H L，Dong M.Effect of oxidized low density lipoprotein on function and membrane surface ultrastructure in human umbilical vein endothelial cells［J］.Chin J Arterioscler，2011，19（1）：34－8.

［4］ Nakamura Y，Romberger D J，Tate L，et al.Cigarette smoke inhibits lung fibroblast proliferation and chemotaxis［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，151（5）：1497－503.

［5］ Yang H Y，Yu JP，Fu G，et al.Interaction between single molecules of Mac-1 and ICAM-1 in living cells：An atomic force microscopy study［J］.Exp Cell Res，2007，313（16）：3497－504.

［6］ Yu J，Sun S，Jiang Y，et al.Single molecule study of binding force between transcription factor TINY and its DNA responsive element［J］.Polym J，2006，47（7）：2533－8.

［7］ Yu J，Wang Q，Shi X，et al.Single-molecule force spectroscopy study of interaction between transforming growth factorβ1 and its receptor in living cells［J］.J Phys Chem B，2007，111（48）：13619－25.

［8］ Koutsi A，Papapanagiotou A，Papavassiliou A G.Thrombomodulin：From haemostasis to inflammation and tumourigenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（9）：1669－73.

［9］ Hanly A M，Redmond M，Winter D C，et al.Thrombomodulin expression in colorectal carcinoma is protective and correlates with survival［J］.Br J Cancer，2006，94（9）：1320－5.

［10］Raife T J，Lager D J，Madison K C，et al.Thrombomodulin expression by human keratinocytes.Induction of cofactor activity during epidermal differentiation［J］.J Clin Invest，1994，93（4）：1846－51.

［11］Wouwer M V，Conway EM.Novel functions of thrombomodulin in inflammation［J］.Crit Care Med，2004，32（5 Suppl）：S254－61.

［12］魏玉杰，劉惠亮，何玉輝，宋冬林.阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化血管內皮細胞膜超微結構影響的研究［J］.中國藥理學通報，2008，24（2）：240－3.

［12］Wei Y J，Liu H L，He Y H，Song D L.Effect of atorvastatin on the ultramicrostructure of the endothelial cell membrane in atherosclerotic rabbits：observed by atomic force microscope［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24（2）：240－3.

［13］Lee G U，Kidwell DA，Colton RJ.Sensing discrete streptavidinbiotin interactions with atomic force microscopy［J］.Langmuir，1994，10（2）：354－7.