雷帕霉素對皮膚鱗癌細胞體外轉移潛能的影響

郭思佳，查曉軍，周海勝

雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是從吸水性鏈霉菌提取出來的一種新型大環類酯類免疫抑制劑［1］。它可與磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳動物RAPA靶體蛋白（PI3K／AKT／mTOR）信號通路下游分子蛋白mTOR特異性結合，阻斷該信號通路的刺激應答［2］。RAPA近年來一直是國內外的關注熱點，許多研究已經發現RAPA有良好的抗腫瘤效果，包括乳腺癌、肺癌、腎癌等［3］，對腫瘤細胞的生長有很強的抑制作用。最近國外研究發現RAPA還可用于治療阿爾采末病［4］，但對皮膚上皮鱗癌細胞的作用鮮有報道。

皮膚上皮鱗狀細胞癌（鱗癌）是皮膚表皮細胞的惡性腫瘤，又稱為皮樣癌，常見于50歲以上的老年人，高發于頭皮、面部、口舌等處，尤其是皮膚與粘膜交界處。發展快，對組織破壞力強，具有很強的侵襲性和遷移性［5］。臨床治療主要采用根治性切除手術，并聯合術后放療或化療。但由于癌細胞的高侵襲性和高遷移性，易發生復發和轉移，因此臨床上的預后不良。而皮樣癌的發病機制目前尚不清楚，有研究表明，可能由于Ras信號通路的激活，進而活化 PI3K／AKT／mTOR信號通路［6］，促進上皮細胞的過度增殖、遷移和脫（轉）分化，同時導致了表皮屏障的增厚和功能障礙［7］。

本研究旨在觀察RAPA對于上皮鱗癌細胞的作用，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人上皮鱗癌細胞A431，中國協和醫科大學細胞中心實驗室劉德培教授惠贈。高糖DMEM培養基、胎牛血清、雙抗均購自美國Hyclone公司。RAPA為美國Cell Signaling Technology產品（10μmol·L－1）。噻唑藍 MTT購自碧云天公司。基質膠Matrigel為美國BD公司產品。Taq酶、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker均為中國大連寶生物公司產品。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。β-actin引物序列為：Sense：5′-TGGACATCCGCAAAGAC-3′，Antisense：5′-AAGGGTGTAACGCAACTAA-3′，PCR產物 302bp；OPN引物序 列：Sense： 5′-CATACAAGGCCATCCCCGTT-3′，Antisense：5′-ACGGCTGTCCCAATCAGAAG-3′，PCR產物59 bp。兔源抗OPN單克隆抗體、鼠源抗GAPDH單克隆抗體均為Abcam公司產品。Transwell嵌套為Corning產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養用高糖DMEM培養基含10%的胎牛血清和1%青、鏈霉素（P／S），培養條件為5%CO2和37℃。

1.2.2 實驗分組 實驗分為Control（正常對照組）、RAPA處理組（5、10、20 nmol·L－1）。

1.2.3 MTT實驗 取對數生長期的A431細胞，用10 g·L－1胰蛋白酶消化，并吹打成單個細胞，用DMEM制備成約為2×108·L－1的細胞懸液，按12、24、48、72 h 4個時間梯度準備4個96孔板，每孔加入100μl約2×104個細胞，待細胞貼壁后，在每個時間梯度按照預定的實驗分組進行處理（每組設5個復孔），每孔加入10μl配制好的MTT溶液（5 g·L－1），在培養箱內繼續孵育4 h后，每孔加入100μl的Formanzan溶解液，在培養箱內繼續孵育，直至在光學顯微鏡下觀察發現Formanzan全部溶解，在570 nm測定吸光度（OD）值。計算抑制率／%＝（對照組吸光度平均值－實驗組吸光度平均值）／對照組吸光度平均值×100%，并作圖。

1.2.4 劃痕愈合實驗 取狀態良好的A431細胞鋪板，鋪勻細胞，待生長密度至90%時，換用1%低血清培養基培養，用10μl槍頭劃痕，同時在RAPA處理組中加入適當濃度的RAPA。37℃繼續培養，按0、12、24、36、48 h時間梯度觀察并拍照，重復 3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 A431細胞饑餓24 h，用10 g·L－1胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，用含0.1%BSA的無血清培養液重懸細胞，稀釋成2×108·L－1，取出 1 ml細胞懸液，加入 1μl濃度為10μmol·L－1的 RAPA，使之終濃度為 10 nmol·L－1，在每個Transwell上室加入200μl細胞懸液，正常對照組加入等體積培養液。每組設5個復孔，重復2次。在下室中加入600μl含5%胎牛血清的培養基，37℃繼續培養24 h，HE染色，顯微鏡下觀察，并計數。

1.2.6 RT-PCR 接種A431細胞于6孔板，細胞貼壁后，依據MTT實驗篩選出的藥物濃度處理細胞，并按12、24、36、48 h收集細胞，提取各組細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄，再通過PCR方法檢測目的基因表達水平。PCR體系為：模板3 μg，Ex Tag酶 0.25μl，10×Ex Tag Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，上下游引物各 1μl，再加入dH2O使終體系終體積為25μl；PCR條件（三步法）是94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s（30個循環）；72℃ 7 min。

1.2.7 Western blot 接種A431細胞于12孔板，貼壁后，依據MTT實驗篩選出的藥物濃度處理細胞，并按12、24、36、48 h時間梯度收集細胞，用 PBS清洗3次，加入適量事先37℃預熱10 min過的細胞裂解液，冰上裂解20 min，用1 ml槍頭刮下細胞，100℃水浴鍋裂解10 min，隨后進行10%SDS-PAGE電泳，后采用恒流170 mA濕轉2 h，使蛋白轉移到PVDF膜上，封閉40 min后（封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST溶液），按1∶1 000稀釋的一抗并孵育，次日洗膜，按1∶5 000稀釋的二抗并孵育，12 h后洗膜，暗室曝光顯影。

1.3 統計學分析 利用IBM SPSSStatistics19.0軟件對數據進行處理，實驗數據以ˉx±s表示，不同組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 RAPA對A431細胞增殖的影響 為研究RAPA對A431細胞增殖能力的影響，采用MTT法檢測不同濃度RAPA對鱗癌細胞A431增殖活性的抑制率，結果顯示（Fig 1）：5、10及 20 nmol·L－1RAPA分別處理A431細胞，其增殖的抑制率均明顯升高（P＜0.05）；與10 nmol·L－1相比較，利用 20 nmol·L－1處理A431細胞時，細胞增殖抑制率變化無統計學意義（P＞0.05）。擬選用10 nmol·L－1RAPA處理A431細胞進行后續試驗。

Fig 1 Proliferation inhibitory rate of A431 cells treated by RAPA at different concentrations（5，10，20 nmol·L－1）

2.2 RAPA對A431細胞遷移的影響 為了研究RAPA對A431遷移能力的影響，選擇10 nmol·L－1RAPA處理A431細胞0～48 h，進行劃痕實驗（Fig 2A）。A431細胞在劃痕后48 h內有明顯遷移現象，而經過RAPA處理的A431細胞，遷移現象明顯減弱。利用Wimasis GmbH計算其劃痕面積，按ˉx±s，并作圖（Fig 2B）。與對照組相比，RAPA組的劃痕面積在24 h后，A431細胞遷移率差異具有顯著性（P＜0.05）。

2.3 RAPA對A431細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗檢測鱗癌細胞A431經RAPA處理前后侵襲能力的變化（Fig 3）。結果顯示：對照組A431細胞穿透基質膜的細胞數（14.8±1.25），提示A431具有一定的侵襲能力；而經過RAPA處理的A431細胞，穿透的細胞數明顯減少（3±1.27）。與對照組相比，穿膜細胞數差異具有顯著性（P＜0.05）。

Fig 2 Migration of A431 cells treated with RAPA（10 nmol·L－1）

2.4 RAPA對A431細胞中OPN的表達影響 為了研究RAPA抑制A431細胞的遷移和侵襲是否與抑制OPN的表達有關，選用10 nmol·L－1RAPA處理細胞，在作用12、24、36、48 h后，分別收集各時間點的細胞提取細胞總RNA和總蛋白。利用RT-PCR和Western blot分別在mRNA水平和蛋白水平檢測細胞中OPN的變化。隨RAPA作用A431細胞的時間增加，RT-PCR結果顯示OPN的mRNA豐度逐漸降低（Fig 4A）；同時Western blot的結果也顯示OPN蛋白逐漸降低（Fig 4B）。

3 討論

Fig 3 Invasion of A431 cells treated by RAPA（10 nmol·L－1）

Fig 4 The expression of OPN in A431 cells treated by RAPA（10 nmol·L－1）

腫瘤細胞中的mTOR信號轉導通路，依靠其結構和功能的特異性，通過調控細胞周期蛋白表達水平，調節細胞周期和細胞的遷移侵襲，進而調控腫瘤細胞的生長及轉化方向［8］。RAPA是mTOR特異性抑制劑［9］，最初作為一種新型的大環類酯類免疫抑制劑應用于臨床。但是近年來，越來越多的研究證實RAPA具有治療腫瘤的潛能［10］：如RAPA明顯抑制乳腺癌細胞的增殖及侵襲遷移、減少肝癌細胞血管內皮生長因子（VEGF）的分泌，抑制腫瘤血管生成。本研究為探討RAPA對人皮膚鱗癌細胞的影響，采用MTT方法觀察其抑制癌細胞的增殖作用。結果顯示使用不同濃度的RAPA作用于A431細胞后，可以有效抑制人上皮鱗癌細胞A431的增殖，且抑制率呈濃度依賴性。

腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力是腫瘤轉移的關鍵因素之一，抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲能力已經成為該領域的研究熱點之一。為證實RAPA是否具有抑制皮膚鱗癌細胞的遷移和侵襲能力，使用RAPA處理A431細胞進行劃痕實驗，結果顯示劃痕愈合距離較對照組細胞明顯減少；說明RAPA可以有效抑制A431遷移；Transwell實驗結果顯示RAPA處理的透膜細胞較對照組明顯減少（P＜0.05），同時證實RAPA可以降低A431細胞的侵襲能力。OPN作為細胞基質蛋白家族成員，在上皮腫瘤的發生發展中，尤其是促進上皮細胞遷移和侵襲，都起到了重要作用［11］。研究證實 PI3K／AKT／mTOR信號通路的活化可以增加OPN的表達，從而促進細胞的遷移和侵襲［12－13］。RT－PCR和 Western blot的結果均顯示在RAPA處理后的A431細胞中OPN的表達均下降。其分子機制可能是RAPA通過抑制PI3K／mTOR信號通路，降低了OPN的表達，進而抑制A431細胞的遷移和侵襲。

RAPA作為mTOR的特定靶向抑制劑，體外實驗證實其可以抑制鱗癌細胞A431的增殖、遷移及侵襲，從而為應用于上皮鱗癌臨床治療提供理論依據。但其抑制的作用結合位點，如整合蛋白受體（α9β1、α4β1、αvβ3、αvβ5）和跨膜蛋白 CD44及其相互作用的分子機制有待進一步研究［14－15］。

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