鹵米松、黃芩提取物聯合用藥對白癜風小鼠模型的影響

祝逸平，王遂泉，盧良君，許愛娥

白癜風是一種自身免疫性疾病，以皮膚黏膜色素脫失為特征，其病因及發病機制尚未明確。免疫抑制劑如鹵米松、糠酸莫米松（mometasone furoate）軟膏等均可抑制局部免疫反應對黑素細胞的損傷，在臨床上有一定的療效。研究報道氫化可的松可增強酪氨酸酶活性，進而促進黑素合成［1］。黃芩具有抗氧化作用、抗炎、調節免疫等功能［2］，且報道稱黃芩苷對TNF-α具有明顯的抑制作用［3］。本課題組已應用莫諾苯宗［4-（Benzyloxy）phenol］構建與人類白癜風相似性極高的白癜風動物模型［4］。因此本研究通過觀察鹵米松、黃芩聯合用藥從發病機制等方面對莫諾苯宗誘導的白癜風小鼠的發生發展的影響，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物來源 C57BL／6小鼠，♀，體質量（15±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司［生產許可證號 SCXK（滬）2012-0002］。

1.2 藥品與試劑 莫諾苯宗（Sigma公司，美國），由杭州市第三人民醫院制劑室制備成不同濃度乳膏。0.05%鹵米松（香港澳美制藥廠）。黃芩提取物（含生藥4 g·L－1，由杭州市第三人民醫院制劑室制備）。

1.3 儀器 反射共聚焦顯微鏡（reflectance confocal microscopy，RCM），美國微維 VIVASCOPE 1500型，波長830 nm，最大輸出16.0 mw；免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM），Fluo View FV1000型（OLYMPUS公司，日本），波長 NIBA：488 nm。

2 方法

2.1 分組及處理 C57BL／6小鼠50只，隨機分為5組：陰性對照組、模型組、鹵米松組、黃芩組和鹵米松聯合黃芩組，每組10只，脫去小鼠背部黑色毛2 cm×2 cm，用刮勺稍用力涂藥。Ⅰ組（陰性對照組）每天涂抹莫諾苯宗乳膏的基質（水包油乳膏基質），50 mg 1次；Ⅱ組（模型組）每天涂抹40%莫諾苯宗乳膏，50 mg 1次；為觀察治療藥物對白癜風發生發展的影響，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組3個治療組采用每日治療藥物和莫諾苯宗各用1次。Ⅲ組（鹵米松組）每天予以鹵米松和40%莫諾苯宗乳膏各50 mg 1次；Ⅳ組（黃芩組）每天予以灌胃3.5 g·kg－1黃芩提取物和40%莫諾苯宗乳膏50 mg各1次；Ⅴ組（鹵米松聯合黃芩組）每天予以鹵米松和40%莫諾苯宗乳膏各50 mg 1次，并灌胃3.5 g·kg－1黃芩提取物；各組小鼠用藥50 d，停藥后連續15 d肉眼觀察小鼠毛發顏色和脫色面積變化，通過RCM觀察皮膚脫色。

2.2 毛發脫色評估 每日肉眼觀察毛發脫色，并進行積分記錄［5］。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位，每個部位總分為5分，每只小鼠共10分。小鼠毛發脫色面積評分標準為：0分，毛發無脫色；1分，毛發有脫色＞0～10%；2分，毛發脫色面積＞10%～25%；3分，毛發脫色面積 ＞25% ～50%；4分，毛發脫色面積＞50%～75%：5分，毛發脫色面積＞75%～100%。

2.3 皮膚脫色觀察 RCM使用的是一種波長為830 nm的二極管激光，它的最大能力不超過35 mW。物鏡的放大倍數為30倍。實時觀察小鼠正常區和脫色區皮膚處在同一層面進行觀察皮膚內黑素細胞，并拍照。

2.4 組織病理 免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡檢測技術具體步驟：用藥部位及其周圍的皮膚組織蠟塊，在切片機上切厚度為4μm的薄片，掛片烤干后，常規脫蠟、水化。②蒸餾水沖洗2 min×3次，PBS浸泡5 min。③石蠟切片置于微波爐中，95℃微波抗原熱修復30 min，蒸餾水沖洗2 min×2次，PBS沖洗2 min×2次，擦去樣品周圍液體。④10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，傾去血清，勿洗。⑤滴加兔CD8單克隆抗體（Zsgb-Bio公司），4℃過夜，PBS沖洗，5 min×3次。⑥滴加FITC標記羊抗鼠的二抗（Zsgb-Bio公司）。室溫反應2 h，PBS沖洗，5 min×3次。90%甘油，薄的蓋玻片封片。用FluoView FV1000型免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡檢測CD8＋T細胞的熒光定量表達，采用單一綠色熒光通道觀察，在488 nm波長以上掃描觀察。觀察并由計算機自帶掃描分析軟件測定，每張切片選取熒光表達最強的5個視野（200×）中單位面積CD8＋T細胞的熒光強度。

2.5 血清細胞因子檢測 眼眶采血，分離血清，ELISA法分別測定IL-6、TNF-α，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.6 統計學分析 數據測定結果以ˉx±s表示，采用t檢驗進行統計學分析。

3 結果

3.1 中西藥聯合治療對莫諾苯宗誘導的白癜風小鼠毛發脫色情況的影響

3.1.1 模型組小鼠脫色情況 用藥部位在實驗d 17開始出現脫色毛發點狀簇集，d 21全部小鼠的用藥部位出現脫色，且脫色范圍逐漸擴大，至d 25～30形成片狀（Fig 1A，紅色圓圈），用藥50 d，皮損擴大并部分融合；軀干的非用藥部位在實驗d 27開始出現毛發脫色（Fig 1A，紅色箭頭）。至實驗d 50，有5只小鼠在軀干部位有脫色，并5只尾巴部位出現粟粒大的脫色（Fig 1B），2只耳朵上呈現針尖樣脫色；停藥后連續觀察15 d，小鼠毛發脫色部位的顏色和面積變化。結果示多數小鼠脫色穩定，僅有1只小鼠有少量復色，3只小鼠非用藥部位的脫色范圍呈現擴大。

3.1.2 陰性對照組小鼠脫色情況 陰性對照組小鼠予以莫諾苯宗乳膏的基質外用50 d后，未出現脫色 （Fig 1C）。

Fig 1 Depigmentation induced by monobenzone in mice

3.1.3 中西藥聯合治療對脫色的發生率和時間的影響 Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組全部小鼠用藥部位出現脫色，其非用藥部位脫色的發生率分別為50%、30%、50%和20%。

Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組小鼠的用藥部位最早出現脫色的時間分別為實驗d 21、d 18和d 26出現脫色，而Ⅱ組在實驗d 17開始出現脫色。且這3組小鼠的用藥部位出現脫色的平均時間取整數為在23、19和29 d，Ⅲ組和Ⅴ組較模型組明顯延遲。

Ⅲ組和Ⅴ組小鼠非用藥部位出現脫色的開始和同組脫色的平均時間也較模型組明顯延遲。而Ⅳ組療效不明顯。Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組小鼠的非用藥部位出現脫色的開始時間分別為實驗d 35，d 30和d 38出現脫色，而Ⅱ組在實驗d 27開始出現脫色。且這3組小鼠的非用藥部位出現脫色的平均時間取整數為37、31和39 d，較模型組明顯延遲。

從上可見Ⅳ組療效不明顯，Ⅲ組和Ⅴ組對模型小鼠均具有效果，且Ⅴ組效果更為明顯。

3.1.4 中西藥聯合治療對脫色的面積評分和穩定性的影響 Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組脫色面積評分結果顯示黃芩組療效不明顯，Ⅲ組和Ⅴ組小鼠的脫色面積均較模型組小（P＜0.05），在非用藥部位的脫色面積差異更明顯。見Tab 1。

Ⅱ組停藥后15 d內模型組中有1只小鼠出現少量復色，只有3只脫色面積有少量擴大。Ⅳ組小鼠有1只出現少量復色，Ⅴ組小鼠有4只小鼠有不同程度復色，Ⅲ組有2只小鼠有復色跡象，Ⅲ組和Ⅴ組小鼠均沒有出現擴大現象。

3.2 RCM觀察皮膚脫色 活體下觀察皮膚的黑色素及黑素細胞顯示：Ⅰ組小鼠RCM顯示色素正常，色素分布均勻，折光強（Fig 2A）；Ⅱ組小鼠RCM顯示色素缺失，折光弱（Fig 2B）。Ⅲ組小鼠RCM顯示樹突狀，折光明亮的黑素細胞（Fig 2C）；Ⅳ組小鼠RCM顯示色素缺失，折光弱（Fig 2D）；Ⅴ組小鼠RCM顯示較多的樹突狀，折光明亮的黑素細胞（Fig 2E）。

3.3 皮膚組織的病理學改變 免疫熒光顯示：Ⅰ組在真皮淺層有CD8＋T細胞有極少量浸潤（Fig 3A），Ⅱ組CD8＋T細胞浸潤明顯（Fig 3B），Ⅲ組 CD8＋T細胞浸潤較模型組略有減少（Fig 3C），Ⅳ組CD8＋T細胞浸潤明顯（Fig 3D）和Ⅴ組CD8＋T細胞浸潤明顯減少（Fig 3E）。見Fig 3。

3.4 CD8＋T細胞表達量差異 免疫熒光顯示用藥部位脫色區的CD8＋T細胞表達量的變化顯示Ⅲ組和Ⅴ組CD8＋T細胞表達較模型組差異明顯（P＜0.05），且Ⅴ組差異更為明顯。Ⅳ組較模型組沒有差異（P＞0.05）。見 Tab 2。

Tab 1 Depigmentation area score at the monobenzone application and non-application parts（ˉx±s，n＝10）

Fig 2 Melanin and melanocyte in vivo by RCM

Fig 3 Microscope images of CD8＋T cell infiltrating condition

Tab 2 Expression of CD8＋T cell（ˉx±s，n＝10）

3.5 血清中IL-6、TNF-α的含量差異 Ⅲ組小鼠血清中IL-6的含量較模型組差異不明顯（P＞0.05），Ⅳ組和Ⅴ組較模型組有明顯差異（P＜0.05）；Ⅲ組小鼠血清中TNF-α的含量較模型組差異無統計學意義（P＞0.05），Ⅳ組和Ⅴ組較模型組差異有統計學意義（P＜0.05）。見Tab 3。

Tab 3 Expression of IL-6 and TNF-αin serum（ˉx±s，n＝10）

4 討論

早在1939年有研究者發現在長期局部接觸莫諾苯宗可以引起健康個體產生白癜風［5－6］，不僅可以在接觸部位甚至在較遠的部位也能產生色素脫失，這種脫色作用主要是通過酪氨酸酶與活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的相互作用完成［7］，引起系統性的自身免疫反應，并作用于黑素細胞，從而導致色素脫失，且這種色素脫失與職業暴露性的白癜風沒有明顯差異［5］。因此我們在此基礎上構建了小鼠的莫諾苯宗誘導的白癜風模型［4］，本實驗觀察鹵米松單獨用藥及其與黃芩提取物聯合用藥對白癜風小鼠的治療作用，從發病機制上抑制CD8＋T細胞及炎癥因子的釋放。實驗結果表明，莫諾苯宗誘導小鼠出現白癜風，如外用莫諾苯宗乳膏后不僅在用藥部位出現脫色，且在非用藥部位出現明顯脫色，如耳朵和尾巴等。這特點明顯區別于過氧化氫和氫醌等脫色劑只限于在用藥部位出現脫色［8］。為觀察治療藥物對白癜風發生發展的影響，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組3個治療組采用每日治療藥物和莫諾苯宗各用1次。結果顯示經鹵米松單獨用藥及其與黃芩提取物聯合用藥后，出現脫色時間延遲，面積縮小；非用藥部位脫色的發生率相應降低及復色現象明顯。

近年來，對CD8＋T細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）深入研究明確其在白癜風發病中的重要作用。研究報道人類白癜風皮損處CD8＋T細胞浸潤明顯［9－10］，CD8＋T細胞是識別來源于黑素細胞表面的主要組織相容性復合物-1（major histocompatibility complex，MHC-1），CD8＋T細胞還可以分泌 IFN-γ和 TNF-α等，并誘導黑素細胞的凋亡［10］。實驗結果顯示模型小鼠脫色部位的真皮淺層CD8＋T細胞浸潤明顯，而鹵米松組和鹵米松聯合黃芩提取物組局部CD8＋T細胞浸潤明顯減少，這一現象說明這兩種療法從白癜風發病機制方面阻斷其發生和發展，從而引起這兩組小鼠在脫色時間、脫色面積和復色等情況的變化。

細胞因子與黑素細胞表面的細胞因子受體結合影響黑素細胞的生長、分化、增殖、凋亡及其黑素產生和轉運的過程，在白癜風的發生發展過程中起重要作用。如IL-6增加黑素細胞的細胞間黏附分子-1的表達，導致B細胞的活化，產生自身抗體，引起黑素細胞的破壞。TNF-α可激活誘導型一氧化氮合酶，產生大量的一氧化氮，對黑素細胞產生細胞毒性作用。實驗研究表明模型組小鼠外周血清中IL-6和TNF-α的含量較陰性對照組小鼠明顯升高，這一結果與人類白癜風血清中IL-6和TNF-α水平增高一致［11－12］。鹵米松組較模型組無明顯變化，而經過黃芩單獨治療和鹵米松聯合黃芩治療后IL-6和TNF-α明顯降低，這一結果與報道有關黃芩抑制炎癥性細胞因子一致［13］，說明黃芩通過抑制炎癥性細胞因子釋放從而達到抑制黑素細胞破壞。

由此可見，鹵米松具有較強的改變免疫狀態、抗炎、避免新生的黑色素細胞破壞、抑制活性黑色素細胞進一步損傷及促進黑色素細胞的恢復等作用，但它是強效糖皮質類固醇，大劑量和長期使用引起不良反應。黃芩可抑制炎癥性細胞因子釋放［13］，激活酪氨酸酶活性，提高黑素含量［14］和抗氧化活性［15］等作用。因此鹵米松、黃芩提取物聯合用藥符合辨證施治、內外結合的作用，在以后的臨床用藥中可以減少鹵米松用量，減輕其副作用，并能提高療效。以上實驗結果為臨床白癜風的治療提供參考。

參考文獻：

［1］ 鄧瑞春，周 勇，章金剛，等.氫化可的松對B-16黑素瘤細胞酪氨酸酶及黑素生成影響研究［J］.中國藥理學通報，2002，18（4）：433－6.

［1］ Deng R C，Zhou Y，Zhang JG，et al.Effect of hydrocortisone injection on tyrosinase activity and melanogenesis of B-16 murine melanoma cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，18（4）：433－6.

［2］ Wu R L，Feng S，Wang JD.Stay on the inhibition effect of baicalin and baicalin metallic coordination［J］.Sci Technol Rev，2006，24（2）：212.

［3］ 萬巧鳳，顧立剛，殷勝駿，等.黃芩苷對FM1肺炎小鼠肺損傷的作用機制研究［J］.中國藥理學通報，2012，28（2）：208－12.

［3］ Wan Q F，Gu L G，Yin S J，et al.Mechanism of Baicalin on lung tissue injuryof mice with FM1 induced pneumonia［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：208－12.

［4］ Zhu Y P，Wang SQ，Xu A.A mouse model of vitiligo induced by monobenzone［J］.Exp Dermatol，2013，22（7）：499－501.

［5］ Forman L.A note on the depigmentary properties of monobenzylether of hydroquinone［J］.Br J Dermatol，1953，65：406－9.

［6］ Becker Jr SW，Spencer M C.Evaluation of monobenzone［J］.J Am Med Assoc，1962，180：279－84.

［7］ Van den Boorn J G，Melief C J，Luiten R M.Monobenzone-induced depigmentation：from enzymatic blockade to autoimmunity［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2011，24（4）：673－9.

［8］ 張蘭蘭，閆 明，劉曉東，霍仕霞.兩種化學脫色劑對兩種動物模擬白癜風作用比較［J］.醫藥導報，2009，28（6）：690－2.

［8］ Zhang L L，Yan M，Liu X D，Huo S X.Comparative study of two kinds of decolorant on two kinds of animal vitiligo models［J］.Herald Med，2009，28（6）：690－2.

［9］ Steitz J，Bruck J，Lenz J，et al.Peripheral CD8＋T cell tolerance against melanocytic self-an tigens in the skin is regu lated in two steps by CD4＋T cells and local inflammation：mplications for the pathophysiology of vitiligo［J］.J Invest Derm atol，2005，124（1）：144－50.

［10］Jasper G，van den Boom J G，Konijnenberg D，et al.Autoimmune destruction of skin melanocytes by perilesional T cells from vitiligo patients［J］.Invest Dermatol，2009，129：2220－32.

［11］ Moretti S，Spallanzani A，Amato L，et al.New insights into the pathogenesis of vitiligo：imbalance of epidermal cytokines at sites of lesions［J］.Pigment Cell Res，2002，15（2）：87－92.

［12］Kim N H，Jeon S，Lee H J，et al.Impaired P13K／Akt activation mediated NF-kappa B inactivation under elevated TNF-αis more vulnerable to apoptosis in vitiliginous keratinocytes［J］.J Invest Dermatol，2007，127（11）：2612－7.

［13］涂獻坤，楊衛忠，石松生，等.黃芩苷抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織TNF-α和AQP-4表達及減輕腦損傷的研究［J］.中國藥理學通報，2013，29（9）：1222－5.

［13］Tu X K，Yang W Z，Shi SS，et al.Inhibitory effect of baicalin on the expression of TNF-αand AQP-4 and the brain damage following cerebral ischemia in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（9）：1222－5.

［14］劉 璋，胡佑倫，韓瑞玲.黑素生成過程中黃芩的調節作用［J］.武漢大學學報（醫學版），2005，26（1）：66－7.

［14］Liu Z，Hu Y L，Han R L.Study on regulation of melanogenesis in responese to radix Scutellariae［J］.Med J Wuhan Univ，2005，26（1）：66－7.

［15］高中洪，黃開勛，徐輝壁.黃芩中黃酮類生物活性的研究進展［J］.中國藥學雜志，1998，33（12）：705.

［15］Gong Z H，Huang K X，Xu H B.Progress of studies in the bioactivities of flavoaids extracted from Scutellaria baicalensis［J］.Chin Pharm J，1998，33（12）：705.