哮喘大鼠血清褪黑素及海馬褪黑素受體1的變化

陳 雯，費廣鶴

支氣管哮喘是一種由多種炎性細胞及氣道結構細胞參與的慢性炎癥性疾病［1－2］。其最重要的病理生理特征是長期慢性缺氧和氣道及系統性慢性炎癥，并導致多臟器功能的損害［3］。中樞神經系統，尤其是海馬，對慢性缺氧和炎性應激非常敏感，是重要的受累部位。海馬作為邊緣系統的一部分，是下丘腦－垂體－腎上腺皮質（HPA）軸的高位調節中樞，富含多不飽和脂肪酸，易受氧化應激的損傷，是腦內各種病理因子表達的敏感區［5－6］。哮喘等慢性應激狀態導致海馬神經元萎縮、損傷，引起海馬結構和功能改變［7］。

褪黑素（melatonin，Mel）是松果體腺等分泌的吲哚類激素，具有抗炎、抗氧化、神經保護等作用［8］。我們的前期研究［9－10］證實，哮喘患者的外周褪黑素水平下降，褪黑素在支氣管哮喘的發生、發展中，可能呈現抗炎、抗氧化等保護性作用［11］。李光等［12］證實，褪黑素能抑制間歇低氧導致的氧化應激，從而對間歇低氧導致的大鼠海馬損傷具有保護作用，但其分子生物學機制尚不明了。哺乳動物中，褪黑素多依賴褪黑素受體（melatonin receptor，MT）發揮作用［13］，其中，褪黑素受體 1（melatonin receptor 1，MT1）在中樞神經系統分布廣泛。因此，我們提出假設：機體為適應哮喘的慢性炎癥及慢性應激反應，可能內源性上調中樞神經系統內褪黑素受體表達，彌補外周褪黑素水平的下降，參與神經保護和神經免疫調節作用。本研究通過建立哮喘大鼠模型，用免疫組織化學、免疫印跡及RT-PCR等技術檢測哮喘組及對照組大鼠海馬組織MT1的分布及表達，結合血清中褪黑素水平的變化，初步探討海馬組織MT1在哮喘發生、發展中的神經保護及神經免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑 山羊抗大鼠MT1抗體（美國，Santa Cruz公司），ABC免疫組織化學試劑盒（美國，Vector Laboratories公司），逆轉錄試劑盒（一步法）及PCR擴增試劑盒（大連寶生物公司），大鼠MT1和β-actin引物（生工生物工程上海有限公司），褪黑素酶聯免疫吸附檢測試劑盒（武漢優爾生科技股份有限公司）。

1.1.2 哮喘模型的建立及分組 成年SPF級♂SD大鼠60只，周齡7周，體質量180～200 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。適應性喂養1周后，隨機分成對照組（20只）和哮喘組（40只）。對照組隨機分為2組，每組10只，均于建模d 17取材，10只用于免疫印跡、RT-PCR及血清褪黑素檢測，10只用于免疫組織化學檢測。哮喘組隨機分4組，每組10只：分別于建模d 5、d 10、d 17取材以行免疫印跡、RT-PCR及血清褪黑素檢查的3組（d 5、d 10、d 17），及d 17取材行免疫組織化學檢測的一組。大鼠飼養在安靜、溫度（22±2）℃、12 h光照及12 h黑暗環境（L7∶00～19∶00，D19∶00～7∶00）。

哮喘模型的制備：①哮喘組：采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA，Sigma，GradeⅢ）致敏及激發建立哮喘模型；d1每只用OVA 500μg加氫氧化鋁干粉8 mg于生理鹽水1.5 ml配成混懸液，腹腔內注射，于d 7予以10 g·L－1OVA 2 ml皮下注射增強致敏。d 14～17連續以8 L·min－1驅動流速超聲霧化器吸入10 g·L－1OVA 30 min，激發哮喘發作。哮喘大鼠表現為煩躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、哮鳴音、腹肌收縮和跌倒。②陰性對照組：d 1和d 7分別予以生理鹽水替代OVA腹腔及皮下注射，d 14～17予以生理鹽水霧化吸入，每天30 min。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 分別在d 5、d 10、d 17 6∶00～6∶20 am收集眼眶靜脈血；全血離心后，血清標本置－20℃冰箱保存待行褪黑素濃度檢測。后予以不同組大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，麻醉狀態下灌流生理鹽水，迅速取出海馬凍在干冰中，－70℃冰箱內儲存，待行免疫印跡及RT-PCR檢查。擬行免疫組織化學檢測的大鼠在d 17 6∶00～7∶00 am予以戊巴比妥鈉麻醉后，打開胸腔，剪破右心耳，經左心室行質量分數為4%的多聚甲醛（PBS，pH 7.4溶解）全身灌注固定，而后取海馬組織浸入質量分數為30%的蔗糖／PBS過夜，常規包埋切片（厚度10 μm）待行免疫組織化學檢測。所有大鼠取材于當日6∶00～7∶00 am完成。

1.2.2 免疫組織化學方法檢測MT1在大鼠海馬組織的表達及定位 采用ABC法進行免疫組化學染色。切片常規脫蠟、水化，質量分數為3%的雙氧水去除內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復，質量分數為 5%的羊血清（Vector Laboratories，USA）封閉，一抗羊抗鼠 MT1（1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），37℃孵育1 h，4℃孵育過夜；滴加生物素標記的二抗IgG，室溫避光孵育30 min，滴加鏈霉親和素－過氧化物酶，室溫孵育1 h，DAB染色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。以細胞內出現棕黃色顆粒、染色強度高于背景非特異性染色者為陽性。

1.2.3 逆轉錄 －聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測MT1 mRNA表達 取30 mg海馬組織，用柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，操作步驟按說明書進行。采用隨機引物方法擴增第1鏈cDNA。MT1聚合酶鏈反應（PCR）引物序列：上游引物5′-TGCCCTGGTGGTTTTCCATT-3′，下 游 引 物 5′-CAGTTTGGGTTTGCTGTCCG-3′；擴增片段大小121 bp。內參β-actin上游引物5′-CACGGCATTGTCACCAACTG-3′，下游引物 5′-AACACAGCCTGGATGGCTAC-3′；擴增片段大小203 bp。PCR反應條件：預變性94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃1 min，共36個循環，擴增產物用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結果，MUVB-20凝膠成像分析系統（Ultralum，USA）對擴增產物進行掃描，分別測定MT1及β-actin的吸光度值。

1.2.4 Western blot檢測MT1蛋白表達 取30 mg海馬組織在研磨器剪碎后，加入蛋白裂解液300μl，液氮內研磨呈勻漿，冰上裂解30 min后，裂解液4℃下13 000×g離心5 min，取上清，并置于－20℃保存。BCA法（BCA protein assay kit；Pierce，Rockford，IL，USA）檢測蛋白含量，加 2×SDS加樣緩沖液，置于PCR儀上98℃變性10 min。按每孔25μg蛋白量加樣，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜后，用PBS緩沖液配制含質量分數為5%的脫脂奶粉的封閉液4℃封閉過夜。分別加入一抗：MT1（1∶200，Santa Cruz）、β-actin（1∶500，Chemicon）和相應二抗孵育，洗膜，ECL顯影，膠片成像。結果使用Kodak 1D image analysis DC290 software測定Western blot條帶灰度值，以β-actin為內參照，進行半定量分析。

1.2.5 酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清褪黑素水平 Mel濃度采用ELISA法檢測，按說明書嚴格操作。吸50μl標準液、對照或樣品，加入酶標試劑50μl溫育，洗滌；加入顯色劑A 50μl，封板膜封板后置37℃溫育30 min，洗滌，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，加終止液50μl，終止反應。以空白對照孔調零，在60 min內在450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。此ELISA試劑盒檢測血清褪黑素水平的范圍為12.35～1 000 ng·L－1。

1.3 統計學處理 所有數據均用ˉx±s表示，使用SPSS 16.0軟件 （SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進行分析。多組均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。

2 結果

2．1 免疫組織化學染色檢測大鼠海馬組織內MT1分布 哮喘組與陰性對照組大鼠海馬組織中MT1表達均呈陽性，表現為聚集性棕黃色陽性顆粒，哮喘組MT1染色強度強于對照組。MT1廣泛分布于海馬組織中，CA1-CA3中MT1陽性的細胞主要集中于三角形胞體中。見Fig 1。

Fig 1 Immunohistochemistry of MT1 in hippocampus

2．2 RT-PCR檢測大鼠海馬組織內MT1 mRNA水平表達 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠海馬組織中MT1 mRNA表達均明顯增加（P＜0.05，n＝4）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠海馬組織中MT1mRNA表達明顯增加（P＜0.05，n＝4），但與d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝4）。d 17哮喘組大鼠海馬組織中MT1mRNA表達較陰性對照組及d 5組均明顯增加（P＜0.05，n＝4）；平均吸光強度與β-actin比較結果顯示，d 17哮喘組MT1分別是陰性對照組及 d 5的（3.75±0.14）倍及（2.14±0.06）倍。見 Fig 2。

2．3 Western blot檢測大鼠海馬組織內MT1蛋白表達水平 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達均明顯增加（P＜0.05，n＝4）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達明顯增加（P＜0．05，n＝4），但與 d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝4）。d 17哮喘組大鼠海馬組織中MT1蛋白表達較陰性對照組及d 5組均明顯增加（P＜0.05，n＝4）；平均吸光強度與βactin比較結果顯示，d 17哮喘組MT1分別是陰性對照組及d 5哮喘組的（3.20±0.16）倍及（1.50±0.05）倍。見 Fig 3。

Fig 2 Gene expression of MT1 in hippocampus

Fig 3 Protein expression of MT1 in hippocampus

2．4 血清Mel檢測 與陰性對照組比較，不同時期哮喘組大鼠血清Mel水平均明顯下降（P＜0.05，n＝10）。與對照組比較，d 5哮喘組大鼠血清Mel濃度明顯降低（P＜0.05，n＝10），但與d 10哮喘組無明顯差異（P＞0.05，n＝10）。而d 17哮喘組大鼠血清Mel濃度較對照組及d 5組均明顯下降（P＜0.05，n＝10）。見 Fig 4。

Fig 4 Serum melatonin levels in different groups

3 討論

本實驗以經典的OVA方法成功復制哮喘大鼠模型，并通過免疫組織化學技術從形態學初步探討了MT1在大鼠哮喘海馬組織中的分布及表達，通過Western blot和RT-PCR技術證實了MT1在哮喘大鼠模型海馬組織中的過表達，且在哮喘的發生、發展過程中，其上調趨勢呈時間依賴性；而同期血清褪黑素的水平則明顯下降。

褪黑素是一種受體依賴的吲哚類激素，其作為一種自由基清除劑，具有廣譜抗氧化能力［13］。由于高度的脂溶性，褪黑素可以自由通過血 －腦屏障［14］，并通過MT在中樞神經系統內參與神經免疫調節及神經保護作用。MT1及MT2在視交叉上核（SCN）、小腦、下丘腦、基底節、海馬等區域均有表達，尤其在海馬組織表達非常豐富［15］。本課題組先前的研究［9－10］證實，哮喘患者血清中褪黑素水平的下降，提示褪黑素可能參與哮喘的發病機制，但其與MT的關系及分子機制尚不明了。

近年來研究［16－17］表明，哮喘的發生、發展過程中，中樞神經系統與免疫系統之間存在著雙向的聯系及相關調節，如哮喘大鼠中樞神經系統中SP、c-FOX蛋白等與肺內呈現同樣的上升趨勢，哮喘的發病機制中可能存在神經免疫調節的參與。孔祥英等［18］指出，哮喘的慢性炎癥及慢性缺氧可引起海馬形態學的改變和炎性損傷。本實驗模擬了哮喘的發生、發展過程，從形態學、基因及蛋白水平證實了哮喘大鼠海馬組織MT1表達的進行性上調。海馬組織MT1的高表達彌補了外周褪黑素水平的下降，作為反饋性代償，在哮喘所致的慢性缺氧和應激狀態下發揮抗炎及抗氧化作用，參與清除自由基，并與HPA軸相互影響，可能參與神經保護和神經免疫調節。本實驗中，海馬MT1表達的增高在哮喘的發生、發展過程中呈現時間依賴性模式，即隨大鼠對變應原（OVA）的接觸時間逐漸增加，而血清中褪黑素水平逐漸下降，外周與中樞神經系統內指標變化的時間相關性表明兩者間可能相互影響，且與哮喘的發生、發展存在著某種因果聯系。在大鼠哮喘模型的建立過程中，海馬組織MT1在基因及蛋白水平表達上調的一致性，進一步證實MT1水平的增加源于哮喘大鼠內源性的基因調控。上述實驗結果證實了我們預先的假設，即在哮喘的發生、發展過程中，血清褪黑素水平逐漸下降，海馬MT1水平逐漸增加，表明MT1在哮喘大鼠模型的中樞神經系統中起著重要的神經保護和神經免疫調節作用。

綜上所述，在哮喘的慢性炎癥及慢性應激過程中，海馬MT1水平的內源性上調，可能是機體應對血清褪黑素外周水平降低的一種適應性代償，增強了褪黑素在中樞神經系統中的抗炎及抗氧化作用，從而參與哮喘的發病機制及神經免疫調節。其對褪黑素在哮喘的治療提供了新的途徑。

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