甲基苯丙胺所致的大鼠神經毒性損傷及nNOS抑制劑的保護作用

徐靜濤，張 付，楊幸怡，謝衛兵，李麗增，劉 超，王慧君

(1.南方醫科大學基礎醫學院法醫學系暨南方醫科大學司法鑒定中心，廣東廣州 510515;2.廣東省公安廳公安部法醫病理重點實驗室，廣東廣州 510050;3.廣州市公安局刑事科學技術研究所，廣東廣州 510030)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)俗稱“冰毒”，屬于苯丙胺類興奮劑，是最具代表性和最常見的新型毒品。2000年以后，迅速成為我國濫用增長速度最快的毒品，吸毒人群年輕化和非法制造冰毒業的存在，使我國冰毒濫用已成為嚴重的社會問題［1-2］。目前，關于METH的神經毒性機制，國內外研究結果尚未完全明確?，F階段的研究結果顯示，多種機制參與了METH的神經毒性，主要包括氧化應激、神經元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等［3-5］，其中氧化應激是METH所致神經毒性損傷的重要作用機制之一［6-7］。

本實驗室運用蛋白質組學的方法，對METH注射后大鼠紋狀體、額葉皮質、海馬等部位的差異表達蛋白質進行鑒定和分析，發現了一種新型的NO合成調節酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)表達上調，提出了 DDAH1/ADMA/NOS系統可能是NO過表達引起的中樞神經系統損傷的重要途徑［8］。

氧化應激是METH神經毒性損傷作用的重要機制之一。METH作用后導致神經元型一氧化氮合酶(nNOS)活性增強;同時，我們課題組的一項研究結果也顯示，METH可導致腦組織中NO濃度上升［9］。氧化應激過程中生成的過量NO和自由基生成毒性產物ONOO-，可能對神經元產生損傷作用。為了進一步明確NOS在METH中毒模型中的作用及其與METH神經毒性的關系，本研究通過構建加入METH和nNOS特異性的抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)的大鼠模型，進一步完善DDAH1/ADMA/NOS通路的神經毒性作用機制，為進一步研究nNOS活性變化與METH神經毒性的關系提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠24只，♂，體質量(300±5)g，購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 鹽酸甲基苯丙胺購自中國藥品生物制品鑒定所(批號:171212，200803)，純度大于99%;7-NI購自Sigma公司;兔抗鼠nNOS多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶8 000稀釋)均購自北京博奧森生物公司;Tunel熒光法檢測試劑盒購自羅氏公司。高速冷凍離心機購自Sigma-Aldrich公司;瓊脂凝膠電泳儀購自Jun-Yi公司;熒光顯微鏡購自Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理 大鼠隨機分為4組，每組6只動物。動物單籠飼養，自由飲水、取食。實驗前先在飼養室適應3 d。提前將216 mg METH溶解于48 ml純水中，720 mg的7-NI溶解于30 ml的溶液(DMSO ∶異丙醇 ∶純水 =1∶3∶6)中，在注射METH前30 min給SD鼠進行腹腔注射含有7-NI的混合液。第1組(生理鹽水組):腹腔注射生理鹽水，早晚各1次，連續注射3 d;第2組(METH組):腹腔注射METH，15 mg·kg-1，早晚各1次7.5 mg·kg-1，連續注射3 d;第3組(METH+7-NI組):METH注射方法同第2組，并且提前30 min在腹腔注射7-NI，注射劑量為50 mg·kg-1;第4組(7-NI組):腹腔注射生理鹽水方法同第1組，并且提前30 min腹腔注射7-NI，劑量為50 mg·kg-1。末次注射后24 h，2%戊巴比妥麻醉，用4℃生理鹽水進行腦部灌輸，斷頭處死動物，迅速開顱完整剝離腦組織。沿中線切開，將腦組織分離為左右兩個半球，放入-80℃冰箱保存。

1.3.2 行為學變化的研究 注射METH溶液后，立刻觀察大鼠的行為學情況，并記錄相關變化，對大鼠的刻板行為評分參照相關文獻方法［10］。評分標準為:0分:靜止不動，幾乎或根本沒有活動;1分:正?；顒樱紶栍邢蚯暗倪\動;2分:活動伴隨反復的向前探索;3分:持續地向前探索;4分:重復地抬頭、搖頭或旋轉;5分:迅速地搖頭、旋轉或搖頭的背腹運動。

1.3.3 大鼠紋狀體的提取和處理 分別取每組6個樣品的一側腦半球，放在DEPC水處理過的培養皿上，將玻片置于冰盒上，在一側腦半球距中線1 mm和3 mm處作矢狀切面，取兩切口之間的腦組織(為距中線1～3 mm之間，厚度為2 mm的腦組織片)［11］，平放于培養皿上分離切取紋狀體，-80℃冰箱保存。

1.3.4 Western blot檢測大鼠紋狀體nNOS和硝基化蛋白表達 將每組6個腦半球中紋狀體中部分組織兩兩混合，移入勻漿器，加入裂解液;高速冷凍離心機15 000 r·min-1，4℃離心10 min;取上清液，加4倍體積冷丙酮-20℃過夜，15 000 r·min-14℃離心30 min;將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉TBST緩沖液封閉1 h。一抗分別為兔抗鼠nNOS多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗鼠3-硝基酪氨酸單克隆抗體(美國Abcam公司，1 ∶1 000稀釋)，0.1 ml/cm2膜面積，4℃孵育過夜，然后，加入二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，1∶8 000稀釋)，室溫孵育90 min，常規漂洗。將PVDF膜用發光試劑ECL顯色，暗室中曝光到X線片上。凝膠成像系統掃描分析結果。

1.3.5 酶聯免疫分析(ELISA)法檢測紋狀體DA含量 按照ELISA試劑盒說明書的要求，檢測各組組織的DA含量，以空白孔進行調零，在450 nm波長處，使用酶標儀測量各孔的吸光度，所得數據經電腦軟件處理得到各組DA含量。

1.3.6 應用Tunel熒光法檢測細胞凋亡 每組隨機取3個待測的腦半球，在Bregma-0.36 mm處冠切，冰凍切片浸入固定液，室溫固定30 min，然后室溫封閉10 min，浸入通透液中冰上(2～8℃)促滲2 min。陽性對照組織樣本再加入DNase I反應液，室溫處理30 min后，加入TdT反應液，37℃反應60 min，陰性對照樣本在標記反應的過程中不添加TdT酶反應液。將處理好的樣本滴加Mounting Media封片劑。綠色熒光濾光片465～495 nm波長下激發熒光。雙染細胞核 (DAPI和 TUNEL)，DAPI染藍色熒光，TUNEL染綠色熒光，經由Merged后，重疊部位即為細胞進行凋亡的位置。每個切片取4個視野，分別統計凋亡細胞數和細胞總數，并計算出細胞凋亡率。

1.3.7 統計學處理 實驗結果的統計學處理用SPSS 13.0軟件進行。行為學結果不同分組間指標值比較采用析因設計的重復測量方差分析，重復因素為注射次數，當資料不滿足球形檢驗時采用Greenhouse-Geisser法;采用調整的基于估計邊緣均值的LSD法進行不同分組間指標值的多重比較。其余各結果比較均采用單因素方差分析(One-way-ANOVA)，組間比較根據方差齊性檢驗結果采用LSD法或Dunnett T3法分析。

2 結果

2.1 大鼠行為學改變 對照組和7-NI組大鼠注射生理鹽水后，行為活動與正常大鼠無異。METH組和METH+7-NI組大鼠注射METH后約10 min開始出現行為和活動異常，主要表現為運動增多、不自主的扭頭和點頭、嚙齒(磨牙)、立毛、遇響動或輕微刺激易激惹、自發轉圈運動、翹尾，個別動物啃咬前肢皮膚、搔抓胸前部皮膚等，出現自殘行為。行為活動異常持續至注射后約4 h，之后動物表現為倦怠、蜷縮，活動減少。析因設計的重復測量方差分析結果表明:不同分組間指標值差異有顯著性(F=710.109，P＜0.01);不同注射次數間指標值差異無顯著性(F=2.157，P＞0.05);分組與注射次數間的交互效應不明顯(F=0.611，P＞0.05)，即分組間的差別不隨注射次數的不同而改變，如輪廓Fig 1顯示。采用調整的基于估計邊緣均值的LSD法進行不同分組間指標值的多重比較，METH組、METH+7-NI組的指標值均明顯高于7-NI、Control組(P＜0.01)，METH、METH+7-NI組間差異無顯著性(P＞0.05)，7-NI、Control組間差異無顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Profile plots of stereotyped behavior of rats

2.2 大鼠紋狀體nNOS蛋白和硝基化蛋白的表達情況 大鼠紋狀體nNOS蛋白Western blot結果如Fig 2所示，METH組和METH+7-NI組均發現目的蛋白條帶，生理鹽水組和7-NI組均未發現目的蛋白條帶。METH組紋狀體中nNOS蛋白表達水平較生理鹽水組明顯升高(P＜0.01)，而METH+7-NI組nNOS表達水平較METH組明顯降低，相差約3.91倍(P＜0.01)。大鼠紋狀體硝基化蛋白Western blot結果如Fig 3所示，生理狀態下硝基化蛋白有少量的表達;在METH毒性作用下，50 ku和80 ku范圍處，硝基化蛋白表達明顯升高，總體升高水平約為對照組的3.62倍(P＜0.01);7-NI可有效降低硝基化蛋白的表達，與METH組相比相差約2.17倍(P＜0.01)。

Fig 2 Relative expression of nNOS protein

Fig 3 Relative expression of nitroproteins

2.3 紋狀體DA含量 各組間比較采用單因素方差分析，經方差齊性檢驗，方差齊，多重比較采用Shapiro-Wilk法，結果見Fig 4。各組間比較差異有顯著性(F=30.575，P＜0.01)，METH組與其他各組相比，DA明顯降低(P＜0.01)，而METH+7-NI組、7-NI組與對照組比較，DA無差異(P＞0.05)。

2.4 Tunel法檢測大鼠紋狀體細胞凋亡情況Tunel結果表明(Fig 5)，各組間比較差異有顯著性(F=192.786，P＜0.01)，METH 神經毒性作用可引起神經細胞發生大量的凋亡(33.23%，P＜0.01)，而7-NI對凋亡具有明顯的保護作用，可使凋亡率下降至12.91%，約為2.57倍(P＜0.01)。

Fig 4 DA contents in striatum of rats

3 討論

METH的分子結構與DA非常相似，能夠通過多巴胺能神經元軸突細胞膜的多巴胺轉運體(DAT)進入胞內，引起突觸小泡內所儲存的DA和5-羥色胺(5-HT)大量釋放進入細胞質內和突觸間隙內，從而引發一系列的神經毒性作用［12］。在眾多損傷機制中，氧化應激反應與DA的大量釋放之間關系最為密切:過量的DA可引起醌類和超氧化物自由基的不斷生成，通過氧化作用對神經細胞及末梢產生廣泛性的損傷［13］。氧化應激損傷的分子機制主要依賴于兩種有害氧化成分的大量形成，即活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)。

Fig 5 Protective effect of 7-NI on apoptosis in striatum of rats treated with METH by Tunel stain

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是體內催化合成一氧化氮的一組蛋白酶，其中nNOS主要分布于神經細胞，調節中樞神經系統內NO濃度。NO主要由精氨酸經NOS分解產生，正常生理條件下，NO作為一種神經遞質，在大腦內存在一定的濃度，可調制神經細胞的可塑性，并參與記憶和學習過程［14-16］。病理條件下，NO可與氧自由基反應生成過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，引起脂質、蛋白質及DNA氧化，還可使蛋白質酪氨酸殘基發生硝基化，導致細胞功能異常［17］。在中樞神經系統中，METH可誘導NO大量生成［18］，隨即產生具有強氧化性的神經毒素ONOO-［19］。而ONOO-的主要毒理作用就是針對蛋白質的3位酪氨酸進行硝基化修飾，形成3-硝基酪氨酸(3-NT)。正常水平的3-NT有助于維持蛋白質的生理功能，而過度的硝基化作用則傾向于抑制和破壞蛋白質的功能［20］，這可能是METH神經毒性的重要分子機制。

本研究運用Western blot方法，證明METH導致大鼠紋狀體nNOS蛋白表達增高以及部分硝基化蛋白水平升高，說明METH通過影響nNOS的活性，導致腦組織內NO生成增加，從而引發損傷性的蛋白質硝基化作用。盡管研究結果顯示過量NO會對神經系統造成損害，但為了進一步驗證NOS活性升高和METH的神經毒性相關性，我們應用了nNOS特異性的抑制劑7-NI，探討NOS活性變化與METH神經毒性的關系。

我們的結果顯示，在METH給藥前預先給動物注射7-NI，能明顯抑制METH導致的紋狀體DA含量減少，紋狀體內DA量的變化是評價METH神經毒性的主要指標。通過Tunel法進行凋亡細胞染色，我們發現METH能明顯增加大鼠紋狀體細胞凋亡率，考慮上述毒性作用可能由于METH致使機體產生氧化應激反應，多巴胺通道轉運功能障礙，毒性產物蓄積，最后導致神經元凋亡［21-23］。預先給予7-NI保護劑組與METH組相比，凋亡細胞明顯減少，但尚未降至對照組水平。該結果進一步證實了NOS是METH引起細胞凋亡一個關鍵因素，7-NI對其有一定程度的保護作用。但由于METH所致的神經細胞的凋亡是多因素、多途徑共同作用的結果，單純抑制NOS尚不足以使細胞凋亡的程度下降至正常水平。

以往相關研究表明，7-NI能夠在小鼠體內有效保護METH誘導的神經毒性作用，可以緩解DA耗竭和DAT異常下降，并且能夠降低小鼠死亡率，以上結論為我們的研究起到了有益的補充和支持［24-25］。在此基礎上，本研究進一步證明，METH誘導的大鼠紋狀體凋亡與nNOS及其下游的蛋白質硝基化作用可能具有相關性，這一成果屬于首次發現，為今后進一步探索氧化應激作用在METH神經毒性中的分子病理機制提供了可靠依據。

本研究發現，大鼠腹腔注射METH后，出現交感神經興奮、刻板運動、運動增多、精神改變、易激惹等行為，甚至出現自殘現象。METH應用7-NI預處理后，對刻板行為無明顯改善，可能是由于METH的神經毒性損害是多因素、多途徑參與的過程，單獨抑制NOS活性不能完全改善其毒性損害的行為學表現。

總之，本實驗研究結果初步顯示，METH可導致nNOS活性增高、蛋白質硝基化水平升高、DA含量的降低及細胞凋亡增多等多種神經毒性表現，而nNOS特異抑制劑7-NI能部分減輕其神經毒性作用，但對于動物刻板行為沒有保護作用。這些結果為今后應用此動物模型進一步研究nNOS下游通路的作用機制奠定了良好的基礎。

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