蛇床子素對髓核致神經根炎性痛大鼠ERK/MAPK信號通路及COX－2 mRNA表達的影響

吳海璇，馮璐璐，徐 輝，賀秋蘭，李梅娜，魏 明，孫來保，鄒學農

(中山大學附屬第一醫院1.麻醉科、2.骨科，廣東廣州 510080;3.中山大學附屬第二醫院麻醉科，廣東廣州 510120)

椎間盤突出導致的腰腿痛是一種常見病，造成了巨大的社會負擔和經濟負擔。傳統的非手術治療方法，如硬膜外腔注射糖皮質激素和局麻藥雖可在短期內一定程度上緩解疼痛，但其長期療效遭到質疑［1］。蛇床子素又名甲氧基歐芹酚(osthol，Ost)，是從傘形科植物蛇床成熟果實蛇床子(Fructus Cnidii)中提取的香豆素類化合物?，F代藥理研究發現，蛇床子素具有多種生物學活性，如抗心律失常、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗骨質疏松、抗腫瘤及抗細胞凋亡等［2－3］。其中，抗炎鎮痛作用尤為突出［4］。當前研究表明炎癥因素在盤源性腰腿痛(discogenic low back pain，DLBP)的發病中扮演著不容忽視的重要作用［5］。蛇床子素抗炎作用明顯，能從多個環節作用于DLBP的形成和發展過程，研究并闡明其在治療DLBP中的價值和具體作用機制對于開發新的治療藥物具有重要意義。本課題組在前期研究中已發現硬膜外腔注射蛇床子素的鎮痛作用與抑制L4－6背根神經節中環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)［6］、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)［7］、酸敏感性離子通道3(acid-sensing ion channel 3，ASIC3)［8］和降鈣素基因相關肽受體1(calcitonin gene-related peptide receptor 1，CGRPR1)的表達有關，但蛇床子素在脊髓水平的鎮痛機制尚待進一步闡明。脊髓背角細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路是細胞內信號轉導的主要通路之一，在接受傷害性信號刺激后靜息態的ERK可被激活為磷酸化ERK(pERK)，從而啟動下游一系列的適應性反應，將傷害性信號傳入胞內。因此，本研究通過探討硬膜外注射蛇床子素對大鼠腰段脊髓背角ERK通路及對該通路所調控的基因表達的影響，初步闡明蛇床子素在脊髓水平的鎮痛機制，為蛇床子素的臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成年♂ SD大鼠125只，體質量250～300 g，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(粵)2008－0002。分籠飼養，室溫(23±2)℃，維持大鼠12/12晝夜節律(每日8∶00～20∶00光照)。本實驗嚴格遵守中山大學動物保護和使用規定。

1.2 主要試劑及儀器 蛇床子素(110822-200407，廣州市藥品檢驗所)用二甲亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解;兔抗鼠 pERK一抗(4370S，Cell Signaling，USA);兔抗鼠 ERK 一抗(BS1112，Bioworld technology，USA);羊抗兔生物素化二抗(BA1003，武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司);TRlzol Reagent(15596－026，Invitrogen公司);Taq DNA 聚合酶(DR001A，TaKaRa公司);逆轉錄試劑盒和dNTPs購自 Qiagen公司;Frey纖毛儀(Stoelting公司，USA);CFX96熒光定量 PCR儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.3 動物模型建立、分組及處理

1.3.1 動物模型建立 參照文獻［7］建立動物模型，10%水合氯醛麻醉大鼠(3.5 ml·kg－1，ip.)，以髂嵴最高點連線為中心做3 cm左右正中切口，切除左側L5下關節突、L6上關節突和L5半椎板，暴露左側L5背根神經節。取鼠尾近段根部自體髓核(約0.4 mg)，置于L5背根神經節上。將PE-10導管向頭側硬膜外腔輕柔置入約4 mm，另一端從頸后引出封管。術后大鼠單籠飼養，用2%利多卡因10 μl判斷導管位置(注射30 s內出現雙后肢麻痹說明導管位置正確)。Sham組取尾部自體髓核組織，但不將其置于暴露部位，余操作同上。

1.3.2 動物分組及處理 成年♂ SD大鼠125只，隨機分為5組，每組25只，分別為 Blank組、Sham組、NP組、Ost組、Vehicle組，其中Ost組于術后d 6于硬膜外腔給予 82 mmol·L－1蛇床子素 50 μl，即 1 mg·rat－1蛇床子素，Vehicle組給予 10%DMSO 50 μl。各組大鼠分別于術前 1 d，術后 3、6、7、10、14、21 d測定50%機械痛縮足閾值(50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT)，在術后 14 d 測定機械痛閾后，每組隨機取15只大鼠，取術側腰段脊髓背角，Western blot法檢測ERK、pERK蛋白的表達，熒光定量PCR法檢測COX-2 mRNA的表達。

1.4 50%機械痛縮足閾值 (50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT)在制模前，將 SD大鼠每日9∶00～16∶00放于有機玻璃箱中適應環境，并測定術前1 d的基礎值。術后的行為學測試時間定于9∶00～16∶00進行，測試前所有大鼠均在玻璃箱中適應30 min，待安靜后進行測試。根據Chaplan等［9］報道的方法稍加改進，檢測50%MWT:大鼠置于透明有機玻璃箱內自由活動，安靜后以不同折力的von Frey纖毛刺激大鼠足底，避開肉墊使之稍成S形，持續6～8 s。大鼠后肢迅速畏縮、撤回，認為是陽性反應。從2 g開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激，如此連續進行，每個強度反復刺激5次，將出現3次以上陽性反應的最小von Frey纖維強度定為大鼠的50%MWT。兩次刺激之間至少間隔約15 s。

1.5 Western blot檢測脊髓背角神經元中ERK1/2和pERK1/2蛋白表達水平 大鼠深麻醉后，在冰面上迅速取出術側腰段脊髓背角，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中(50 mmol·L－1Tris HCl(pH 7.5)，5 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，10 ml·L－1Triton X-100)，超聲勻漿、水浴、高速離心后取上清。每次電泳前各組樣品隨機取一管上樣測蛋白濃度，以SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后用脫脂牛奶封閉2 h后，在4℃條件下與ERK或pERK一抗(1∶1 000)或抗GAPDH(1∶1 000)共孵育48 h，再與二抗(1∶2 500)室溫下孵育2 h。將膜與ECL試劑反應后依次壓片、顯影、定影，用Image J 6.0軟件采集膠片條帶灰度值。實驗重復3次，將每次實驗中各樣品灰度值與內參GAPDH灰度值相除作為ERK或pERK蛋白相對含量。

1.6 熒光定量RT-PCR法檢測COX-2表達水平取脊髓背角組織，按TRIzol抽提法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA濃度和純度。取適量RNA為模板逆轉錄得cDNA，－20℃保存待用。采用Primer5.0設計基因特異性引物。COX-2引物序列:5'-CTGAGGGGTTACCACTTCCA-3'(上游)，5'-TGAGCAAGTCCGTGTTCAAG-3'(下游);內參 β-actin引物序列:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'(上游)，5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'(下游)，上述引物均由上海生物工程公司合成。PCR反應體系:SYBR Green 1 染料 10 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，dNTP 1 μl，Taq 聚合酶 2 μl，待測樣品 cDNA 5 μl，雙蒸水 30 μl。PCR 體系反應條件:預變性94℃4 min，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環，終延伸72℃ 7 min。實時分析軟件計算每個標本的循環閾值(Ct值)，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數據分析軟件進行分析，且采用 2－ΔΔCt法來計算。

1.7 數據統計方法 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示。用Levene法檢測各組樣本方差是否齊性。方差齊性時，術后同組間不同時間點的50%MWT比較采用重復測量設計的Friedman ANOVA方差分析，術后同一時間點不同組間的50%MWT、ERK及pERK相對蛋白濃度和COX-2 mRNA含量比較采用One-way ANOVA方差分析，差異有統計學意義時用LSD法行兩兩比較;方差不齊時，同組間50%MWT比較采用多因素方差分析，組間比較采用Kruskal-Walllis秩和檢驗，兩兩比較采用Dunnett T3檢驗，P＜0.05時認為差異有統計學意義。pERK和COX-2 mRNA的相關性分析采用Speraman秩相關分析法，P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠硬膜外腔給藥前后50%MWT的變化 各組大鼠術前的50%MWT比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。與Blank組相比，Sham組僅在術后d 1 50%MWT降低有統計學意義，后逐漸恢復至術前水平，而NP組、Vehicle組和Ost組大鼠術后均出現術側后肢50%MWT值明顯降低(P＜0.05)，其中NP組和Vehicle組的痛閾降低一直持續至術后21 d。術后d 6，Vehicle組和Ost組分別于硬膜外腔給予相應藥物，在給藥后各時間點，與Vehicle組相比，Ost組50%MWT明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。

Fig 1 Comparison of 50%MWT before and after epidural application of drug in different groups of rats

2.2 術后d 13各組大鼠脊髓背角ERK表達的變化 硬膜外腔給藥后8 d，即術后d 14，各組大鼠脊髓背角ERK的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 2。

2.3 術后d 14各組大鼠脊髓背角pERK1/2蛋白表達的變化 術后d 14，Blank組和Sham組大鼠脊髓背角pERK1/2表達差異無統計學意義(P＞0.05)，NP、Ost和Vehicle組較Blank組表達增高(P＜0.05)。與 Vehicle組相比，Ost組的 pERK1和pERK2表達均明顯降低(P＜0.05)，NP組的pERK1和pERK2表達水平均較Vehicle組高(P＜0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Expression and relative concentration of ERK1/2 in different groups of rats on postoperative d14 after surgery

Fig 3 Expression and relative concentration of pERK1/2 in different groups of rats on postoperative day 14

2.4 術后d 14各組大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達的變化 硬膜外腔給藥后8 d，即術后d 14，Sham組和Blank組脊髓背角細胞中COX-2 mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)。與Blank組相比，NP組和Vehicle組COX-2 mRNA表達均明顯增高(P＜0.01)，Ost組 COX-2 mRNA表達略增加(P＜0.05)。與 Vehicle組相比，Ost組 COX-2 mRNA表達明顯降低(P＜0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Relative expression of COX-2 mRNA in spinal dorsal horn of different groups of rats on postoperative day 13

2.5 各組大鼠脊髓背角pERK1/2與COX-2mRNA的相關性分析 對各組大鼠脊髓背角pERK與COX-2 mRNA行Spearman秩相關分析，pERK1和COX-2 mRNA秩相關系數r=0.878(P＜0.01)，pERK2和COX-2 mRNA秩相關系數r=0.910(P＜0.01)，表明各組大鼠脊髓背角pERK1/2與COX-2 mRNA表達呈正相關。

3 討論

3.1 蛇床子素對ERK通路的影響 炎癥導致的周圍和中樞神經系統敏感性改變是引起痛覺過敏的主要原因。在脊髓水平，痛覺過敏的神經生理學改變主要表現為異位電活動增多、痛覺傳遞信號通路的持續激活以及突觸傳遞效能的增強，這些神經元的可塑性變化構成神經根炎癥時產生的痛覺過敏、觸誘發痛以及痛輻射等疼痛癥候群行為表現的基礎［10］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)級聯反應是細胞內最主要的共同信號轉導系統之一，其中細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是 MAPK家族的重要成員。近年來研究發現，ERK信號通路作為一條將細胞外信息向細胞核傳遞的通路，在炎癥反應、細胞的增殖和凋亡中均起著重要的調節作用。既往關于蛇床子素對于ERK通路的作用主要集中在神經保護［11］、細胞分化和抗骨質疏松等方面。本課題組在前期試驗中已證實DRG暴露于髓核后，術后d 1脊髓背角淺層pERK蛋白的表達即明顯上調，至少持續至術后21 d，與疼痛行為學改變相一致。且該炎性痛敏能被ERK通路拮抗劑所緩解，并伴有背角pERK表達減少，說明ERK信號通路參與髓核導致的神經根炎性痛。本實驗在此基礎上，于術后d 6硬膜外腔單次注射蛇床子素治療髓核致炎大鼠的已形成了的神經根炎性痛，獲得了確切、長期(21 d)有效的疼痛緩解效果，并伴有腰段脊髓背角pERK蛋白表達明顯減少。我們的研究結果表明抑制脊髓背角pERK通路很可能是蛇床子素鎮痛作用的重要機制之一。

3.2 ERK信號通路通過調控COX-2基因表達介導痛敏 傷害性刺激會使脊髓背角神經元的ERK發生磷酸化，磷酸化的ERK能從胞質轉位至核內，激活相應的轉錄因子，進而啟動基因轉錄，因此ERK通路可通過調節關鍵基因產物的轉錄導致痛覺過敏。研究表明［12］，pERK調控的下游靶基因主要有 COX-2、CGRP、NK-1、強啡肽、內啡肽等。其中，COX-2是以花生四烯酸(AA)為底物生成前列腺素(PGs)過程中的限速酶。而前列腺素，尤其是前列腺素E2(PGE2)，作為重要的炎癥和促傷害介質，在外周和中樞敏感化方面起著十分重要的作用。研究發現，在局部注射完全弗氏佐劑、角叉菜膠及酵母多糖等引起的機械性痛覺過敏的過程中，脊髓背角中COX-2 mRNA和蛋白表達明顯增高［13］?？梢娂顾柚蠧OX-2在外周炎癥誘發中樞機械性痛覺過敏的進程中起著重要作用。在本研究中，筆者發現在形成穩定的神經根炎性痛后pERK和COX-2 mRNA表達明顯上調，且兩者呈較強的正相關，由此可推測ERK信號通路激活后可通過調控COX-2基因的表達介導機械性痛覺過敏。

3.3 蛇床子素與盤源性腰腿痛的關系 隨著近年來對盤源性腰腿痛機制研究的不斷深入，大量研究結果表明，腰椎間盤突出物引起的臨床疼痛癥狀和神經根體征與突出物的病理形態和對神經根的機械壓迫無明確關系 ，而與局部炎癥的聯系極為緊密［14］。因此，我們推測蛇床子素主要是通過其強大的免疫調節和抗炎效應達到緩解DLBP的作用。目前，蛇床子素治療DLBP的機制主要可概括為以下幾個方面:(1)通過抑制關鍵信號通路，減少炎性介質的表達［6，15］，本研究證實了蛇床子素可通過抑制脊髓背角ERK信號轉導通路，減少COX-2基因的表達，從而達到緩解機械通敏的作用;(2)通過對細胞膜上的某些離子通道，如Na+通道［16］、電壓依賴性 L-鈣通道［17］和 3 型酸敏感離子通道 ASIC3［8］等的直接調控作用，降低神經元興奮性，防止中樞敏化的形成;(3)長期大量興奮性遞質的釋放會導致中樞抑制性中間神經元對傷害性信息傳遞的抑制作用減弱，甚至引起抑制性神經元的凋亡，從而導致痛覺過敏。這種中樞去抑制作用是DLBP的重要發生機制之一。而蛇床子素能降低中樞興奮性神經遞質的釋放，并具有神經保護作用，可通過減少中樞抑制性神經元的凋亡防治痛敏;(4)通過抗凝作用，減少毛細血管血栓形成以及增加背根神經節血供等途徑產生協同作用。

綜上所述，ERK/MAPK信號通路在髓核導致的神經根炎性疼痛中扮演著重要角色，本研究證實蛇床子素可通過抑制ERK信號通路的激活下調COX-2的表達而緩解痛覺過敏。因此，本研究為蛇床子素治療椎間盤突出導致的神經根炎性痛提供了一個新的理論依據，為臨床上開發新的抗炎鎮痛藥物提供了新的科學指導。

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