二烯丙基二硫活化NADPH氧化酶誘導人白血病K562細胞凋亡

易 嵐，伍尤華，譚 暉，何 潔，李林蔚，單 健，蘇 琦

(南華大學1.腫瘤研究所、2.藥學與生物科學學院、3.附屬第一醫院腫瘤科，湖南 衡陽 421001)

誘導腫瘤細胞凋亡已經成為治療腫瘤的新方法之一［1］。研究表明［2］，眾多的細胞因子和藥物具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力。其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗癌作用正日益受到關注。研究顯示，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)，大蒜主要有效成分之一，可誘導胃癌、肺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞凋亡［3］。我們前期工作已經證實，DADS不僅可誘導人結腸癌等細胞分化與凋亡，而且可誘導人白血病細胞分化與凋亡［4］。DADS對人白血病細胞具有雙效作用，小劑量DADS(＜1.25 mg·L－1)誘導人白血病細胞分化，其機制與抑制JAK1/STAT3的酪氨酸激酶活性、下調STAT3與Myc核內表達水平，提高組蛋白乙酰化水平及p21WAF1表達上調有關［5］。而中等劑量 DADS(＞1.25 mg·L－1)可誘導人白血病細胞凋亡，其機制與G2/M期阻滯，活性氧，抑制 ERK 和激活 p38，下調 Bag-1、Bcl-2，上調Fas-L、Bax 等有關［6－7］。但具體機制尚不清楚。

在前期工作的基礎上，我們應用蛋白質組學技術篩選出7個與DADS誘導人白血病細胞凋亡的相關的差異蛋白，其中Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)表達明顯上調［8］，Rac2 是 NADPH氧化酶的6個亞基之一，是NADPH氧化酶活化必不可少的。NADPH氧化酶的激活受高度調控，在此過程中，Rac2與 p67phox相互作用起著關鍵作用［9］。NADPH氧化酶是誘導產生ROS的主要來源之一，而ROS可觸發多種信號轉導途徑，引起細胞凋亡。本研究在前期工作的基礎上，研究DADS活化NADPH氧化酶，通過活性氧途徑誘導人白血病K562細胞凋亡，進一步闡明白血病的發病機制，為白血病的誘導凋亡治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 DADS為Fluka公司產品，小牛血清是杭州四季青生物工程公司產品。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產品。RNA抽提試劑盒Ⅱ為Omega公司產品，TRIzol試劑為Invitrogen Life Technologies產品。免疫共沉淀試劑盒為Santa Cruz公司產品。2'，7'-二氯氫化熒光素二脂(DCFHDA)、phorbol myristate acetate(PMA)、diphenyleneiodonium(DPI)、Rac2、p67phox等試劑為 Santa Cruz公司產品。二抗為Abcam Biotechnology公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養采用常規培養，培養液為含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中培養，每3～4 d換液傳代。取對數生長期細胞用于實驗，DADS用培養基稀釋到所需濃度。

1.2.2 MTT檢測 用含10%胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔103～104個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μl，設3個復孔。加入處理因素并設0對照、空白對照、溶酶對照和不同濃度DADS處理組。在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中常規培養，繼續培養72 h。于結束前4 h除對照組外，每孔加 MTT溶液(5 g·L－1用 PBS配制，pH=7.4)20 μl，繼續孵育 4 h，終止培養。離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，充分融解結晶物。酶聯免疫檢測儀上測各孔吸光度，檢測波長570 nm，按下列公式計算抑制率(IR%)。

1.2.3 Real-time PCR引物合成 利用 Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，送交寶生物工程大連有限公司合成。實時定量PCR使用的管家基金(β-actin)以及NADPH氧化酶的6個亞基引物分別為如下所示。β-actin正義引物序列為5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，反義引物序列為:5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，產物長度為211bp;NCF2正義引物序列為:5'-GAAGAAGGGCAATGATAACTGG-3'，反義引物序列為:5'-TAGGAGGAGCTGGGATGTCG-3'，產物長度為155bp;RAC2正義引物序列為:5'-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3'，反義引物序列為:5'-GATGGTGTCCTTGTCGTCC-3'，產物長度為143bp;CYBB正義引物序列為:5'-CAAGATGCGTGGAAACTACCT-3'，反義引物序列為:5'-TGACTTGAGAATGGATGCGAA-3'，產物長度為138bp;CYBA正義引物序列為:5'-ATTGTGGCGGGCGTGTTT-3'，反義引物序列為:5'-CACGGCGGTCATGTACTTCTGT-3'，產物長度為 102bp;NCF1正義序列為:5'-ACCCTGAGCCCAACTATGC-3'，反義序列為:5'-GGACGGGAAGTAGCCTGTG-3'，產物長度為170bp;NCF4正義引物序列為:5'-CAGCCTGATGCCTCCTTACTC-3'，反義引物序列為:5'-TCTGGAACTCCCGCCTTGT-3'，產物長度為120bp。按照Total RNA KitⅡ說明書提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。cDNA合成:將2 μg的總RNA 72℃ 10 min預變性，冰上冷卻3 min后，按RT試劑盒說明書依次加入各試劑，建立一個總反應體積20 μl的體系，42℃90 min，冰上冷卻2 min，－20℃保存備用。Realtime PCR擴增:將標準曲線樣品和待測樣品分別加入到Real-time PCR反應液中，進行Real-time PCR擴增和檢測。幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置總體積為25 μl反應體系，置于Real-time PCR儀上進行PCR反應。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.2.4 細胞內活性氧檢測 收集細胞，用Hanks液洗滌細胞 2 次，加入終濃度為 10 μmol·L－1的DCFH-DA 400 μl，充分混勻，在37℃條件下避光反應50 min，用Hanks液洗滌細胞3次以去除細胞外熒光劑，用500 μl Hank's液重懸細胞，37℃條件下水浴10 min，流式細胞儀分析熒光強度，激發波長488 nm，發射波長530 nm。

1.2.5 Western blot檢測 細胞裂解:分別收集各組細胞，冰PBS洗兩次，每1×107個細胞濃度加入100 ～150 μl裂解液(100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF)，冰上裂解1 h，4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，上清液即為細胞總蛋白。根據Bradford法進行蛋白含量的測定。蛋白變性后經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCL 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封閉1 h，用特異性一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，相應的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學發光劑檢測蛋白質印跡，薄層掃描儀測定印跡區帶的光密度值。

1.2.6 免疫共沉淀 按照Seize Classic Mammalian Immunoprecipitation試劑盒說明書進行，將得到抗體復合物進行SDS-PAGE電泳，再進行Western blot檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS 12.0統計分析軟件，Student't-test法進行差異顯著性檢驗，數值用±s表示，用Sigma Plot10.0軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 MTT檢測DADS對K562細胞的增殖抑制作用 如 Tab 1 所示，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L－1DADS處理人白血病K562細胞，抑制率分別為32.48%、59.34%、66.42%、81.05%、87.09%，抑制率呈濃度依賴性增加(P＜0.05)。Tween80對照組對細胞增殖無明顯抑制作用(P＞0.05)。這些結果表明，DADS以劑量依賴性抑制K562細胞的生長。IC50值在 5.0 mg·L－1左右。

Tab 1 OD570value of different concentrations of DADS treated K562 cells for 48 hours

2.2 DADS誘導K562細胞凋亡過程中 NADPH氧化酶各亞基mRNA表達水平 Real-time PCR結果如Fig 1所示，6 mg·L－1DADS作用K562細胞6 h后，NADPH氧化酶復合物的6個亞基(包括CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4 和 RAC2)相對定量的值分別為1.31×10－3±1.1×10－4、9.85 ×10－4±2.3 ×10－5、1.01 ×10－3±1.1 ×10－4、3.94 ×10－5±3.3 ×10－6、1.65 ×10－3±2.1 ×10－4、1.48 ×10－3±1.8×10－4，較處理前的 1.08 ×10－3±1.3×10－4、4.03×10－4±1.1×10－5、2.57 ×10－4±2.0 ×10－5、1.67×10－5±2.5 ×10－6、1.22 ×10－3±1.2 ×10－4、1.04×10－3±1.4 ×10－4，NADPH 氧化酶各亞基mRNA水平都明顯上調(P＜0.05)。

Fig 1 Real-time PCR analysis of mRNA levels of components of the NADPH oxidase in K562 cells treatedby 6 mg·L －1DADS for 6 hours

2.3 Rac2在DADS誘導K562細胞凋亡過程中表達上調 Rac2對NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6個亞基之一，Rac2是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析結果如Fig 2所示，與對照組相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用 K562 細胞24 h后，蛋白 Rac2的表達水平明顯上調(P＜0.05)。

Fig 2 Western blot analysis of expression of Rac2 in K562 cellsinduced by different concentrations of DADS

2.4 免疫共沉淀檢測NADPH氧化酶亞基Rac2與p67phox結合 免疫共沉淀結果如Fig 3所示，通過用Anti-Rac2沉淀K562細胞的裂解蛋白，Western blot檢測到 p67phox存在。實驗結果表明在DADS誘導的 K562細胞凋亡過程中，有 Rac2和p67phox的結合，即存在NADPH氧化酶的活化。

Fig 3 Western blot analysis p67phox in K562 cells after subsided by Anti-Rac2

2.5 NADPH氧化酶激活劑和抑制劑對DADS誘導K562細胞凋亡的影響 我們采用NADPH氧化酶的激活劑PMA和NADPH氧化酶的黃素蛋白抑制劑DPI來進一步研究NADPH氧化酶對DADS誘導K562細胞凋亡的影響。

流式細胞術檢測凋亡細胞百分率結果如Fig 4所示，PMA單獨作用K562細胞24 h，其凋亡細胞百分率為(10.2±1.04)%，PMA與6 mg·L－1DADS聯合處理K562細胞24 h，凋亡細胞百分率為(40.5±2.03)%，與 DADS單獨處理組(30.9% ±1.34)%相比，PMA能明顯提高DADS誘導K562細胞凋亡的作用 (P＜0.05)，DPI單獨作用K562細胞24 h，凋亡細胞百分率為(3.35±0.76)%，可見，DPI并未能誘導K562細胞凋亡。DPI與6 mg·L－1DADS聯合處理K562細胞24 h，凋亡細胞百分率為(17.3±1.03)%，實驗結果表明DPI能抑制DADS誘導K562細胞凋亡(P＜0.05)。

2.6 NADPH氧化酶的活化是DADS誘導K562細胞活性氧主要來源 流式細胞術檢測DCF的熒光強度結果如Fig 5所示，對照組、6 mg·L－1DADS處理K562細胞8 h組、PMA單獨處理組、DADS和PMA聯合處理組、DPI單獨處理組、DADS和DPI聯合處理組，流式細胞術檢測DCF的熒光強度分別為10.2±0.98、33.0±1.65、30.5±1.73、43.7±1.76、10.0±0.98、11.8 ±0.95，可見，PMA 能提高DADS誘導K562細胞活性氧的水平(P＜0.05)，而DPI明顯抑制了DADS作用的K562細胞活性氧的產生(P＜0.05)。

3 討論

誘導腫瘤細胞凋亡已經成為治療腫瘤的一種新的可能性［10］。眾多的細胞因子和藥物都能誘導腫瘤細胞凋亡，其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗腫瘤作用已日益引起人們的關注。DADS作為大蒜提取物中最有效的成分，可以誘導多種腫瘤細胞包括人慢性髓細胞性白血病K562細胞系凋亡，但是其具體機制還有待于進一步研究。我們前期工作已經表明，低劑量(＜1.25 mg·L－1)的DADS具有抗增殖作用，能誘導K562細胞分化［11］。本研究用中等濃度(2.5～20 mg·L－1)DADS來誘導K562細胞凋亡。在我們前期工作的基礎上，本研究進一步證實了DADS對K562細胞的生長抑制作用。MTT實驗結果表明，DADS以劑量依賴方式抑制K562細胞的活性。

本研究 Real-time PCR結果顯示，6 mg·L－1DADS作用K562細胞6h后，NADPH氧化酶復合物的6 個亞基(包括 CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4和RAC2)的mRNA水平都明顯上調(P＜0.05)。Rac2是NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6個亞基之一，Rac2的活化是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析結果表明，與對照組相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用人白血病 K562 細胞24 h后蛋白 Rac2的表達水平明顯上調(P＜0.05)。這些研究結果表明DADS誘導K562細胞凋亡的過程中有NADPH氧化酶的活化。

有研究表明，NADPH氧化酶有6個亞基，在NADPH氧化酶活化過程中，Rac2與p67phox結合是NADPH氧化酶的活化非常關鍵的環節［12］。因此我們應用免疫共沉淀方法來檢測DADS誘導K562細胞凋亡的過程中Rac2與p67phox是否結合，進一步研究在DADS誘導人白血病K562細胞凋亡過程中，是否有NADPH氧化酶的活化。免疫共沉淀結果顯示，通過用Anti-Rac2沉淀K562細胞的裂解蛋白，Westernblot檢測到p67phox存在。實驗結果表明在DADS誘導的K562細胞凋亡過程中，有Rac2和p67phox的結合，也進一步說明有NADPH氧化酶的活化。

Fig 4 Flow cytometry analysis of percentage of apoptosis cells in K562 cells

Fig 5 Flow cytometry analysis DCF fluorescence intensities of K562 cells

為進一步研究NADPH氧化酶與DADS誘導K562細胞凋亡的關系，我們采用NADPH氧化酶的激活劑PMA和NADPH氧化酶的黃素蛋白抑制劑DPI來研究NADPH氧化酶對DADS誘導K562細胞凋亡的影響。流式細胞術檢測凋亡細胞百分率結果顯示，PMA與DADS聯合處理組凋亡細胞百分率明顯高于與DADS單獨處理組，而DPI與DADS聯合處理組凋亡細胞百分率為明顯低于DADS單獨處理組。實驗結果表明，PMA能明顯提高DADS誘導K562細胞凋亡的作用，而DPI能抑制DADS誘導K562細胞凋亡。可見，NADPH氧化酶與DADS誘導K562細胞凋亡密切相關。

研究表明，DADS能誘導腫瘤細胞產生活性氧，產生的活性氧和腫瘤細胞的進一步的命運包括凋亡密切相關［13－14］。我們的前期研究結果顯示，DADS誘導K562細胞凋亡過程中活性氧水平明顯提高［7］。但是活性氧有多種來源，這些活性氧的來源并不確定，NADPH氧化酶的活化是活性氧的一個重要來源之一［15］。盡管我們的研究已經表明，在DADS誘導人白血病細胞凋亡的過程既有NADPH氧化酶的活化，又有活性氧的產生，但是NADPH氧化酶的活化是不是活性氧的主要來源還有待于進一步研究。因此我們用PMA及DPI預處理細胞，以便檢測DADS誘導K562細胞凋亡過程中活性氧的水平，以確定NADPH氧化酶的活化是否DADS誘導K562細胞凋亡過程中活性氧主要來源。流式細胞術檢測DCF的熒光強度結果顯示，PMA明顯提高了DADS誘導K562細胞活性氧的水平，而DPI預處理的細胞卻沒有活性氧的產生。這些結果表明，NADPH氧化酶是DADS誘導K562細胞凋亡過程中活性氧的主要來源。

NADPH氧化酶在多種腫瘤組織中的表達異于組織來源相同的正常組織，其催化產生的活性氧，可以誘導一系列細胞因子，調節細胞周期，調節腫瘤發生、發展和血管生成等等，這些為研究腫瘤發生和治療提供了新的思路。本研究結果不僅表明DADS誘導K562細胞凋亡的過程中有NADPH氧化酶的活化，而且證實了NADPH氧化酶的活化是DADS誘導K562細胞凋亡過程中活性氧產生的主要來源。因此，NADPH氧化酶的活化在DADS誘導人白血病K562細胞凋亡中起著重要作用。當然，DADS誘導人白血病細胞凋亡的確切機制還有待于進一步研究。

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