新型Rho激酶抑制劑DL0805-1大鼠體內藥代動力學初步研究

武玉潔，王夙博，袁天翊，李人則，焦曉臻，謝 平，方蓮花，杜冠華，

1-benzyl-N-（1H-indazol-5-yl）pyrrolidine-3-carboxamide（1-芐基-N-（1-H-吲唑-5-基）吡咯烷-3-甲酰胺，簡稱 DL0805-1）屬于吲唑類化合物（Fig 1）。DL0805-1是由本實驗室在高通量藥物篩選中發現的、具有Rho激酶活性抑制作用的化合物DL0805［1］經結構優化所獲得［2］。體外實驗結果表明，DL0805-1具有良好的Rho激酶抑制活性。

Fig 1 Chemical structural formula of DL0805-1

Rho激酶對細胞的分裂、收縮、黏附、遷移、分泌等活動具有重要調節作用［3－5］。Rho激酶的高表達或過度激活與心血管疾病的發生密切相關［6－7］，現在已經成為新藥研發的重要靶點。研究表明，吲唑類化合物具有明顯的Rho激酶抑制活性［8－9］。我們的前期研究表明，DL0805-1通過多種途徑舒張離體大鼠胸主動脈以及腸系膜微動脈。針對DL0805-1具有藥理活性強、毒性低、合成工藝相對簡單等特點，目前作為心血管保護作用的候選化合物正在深入研究和評價。

本研究通過建立一種HPLC法，對DL0805-1單次尾靜脈注射給藥后大鼠體內的藥動學過程進行考察，得到其藥代動力學參數。為DL0805-1進一步藥物研發提供其初步的藥物代謝動力學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DL0805-1由藥物所合成室謝平教授提供，純度＞99%，甲醇、乙腈（ACN）為HPLC級、4-對乙酰氨基酚（4-acetaminophenol，Sigma公司，美國）、乙酸乙酯等為市售分析純。

Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國），高速冷凍離心機（Backman，美國），Eppendorf離 心 機 （Eppendorf公 司，德 國 ），NEVAPTM111氮吹儀 （Organomation Associates，美國）。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠，♂，體質量220～240 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001。所有動物自由飲食飲水，自然照明，室溫（20～24）℃。

1.3 色譜條件 檢測系統：Agilent 1200-DAD；色譜柱：AgilentTC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；檢測波長：235 nm；柱溫：35℃；進樣量：20μl；運行時間：15 min；流速：1 ml·min－1；流動相：0～5 min：ACN-0.05%H3PO4（15∶85），5.01～11 min：ACN－0.05%H3PO4（25∶75），11.01～15 min：ACN-0.05%H3PO4（15∶85）。

1.4 標準溶液及內標溶液的配制

1.4.1 標準溶液 精密稱取10 mg DL0805-1，加入1 ml甲醇充分溶解，配制成10 g·L－1的貯備液，用流動相稀釋成不同濃度的標準溶液。

1.4.2 內標溶液 精密稱取4-對乙酰氨基酚標準品5 mg，加入1 ml甲醇充分溶解并混勻，配成5 g·L－1的母液，以流動相稀釋成50 mg·L－1，作為內標工作液。

1.5 空白血漿樣品處理 精密吸取大鼠空白血漿150μl，置于1.5 ml離心管中，加入內標工作液10 μl，再加乙酸乙酯1 ml，渦旋震蕩3 min，1.34×104r·min－1離心10 min，取1 ml上清于另一空離心管中，氮氣吹干，用100μl流動相復溶，渦旋振蕩3 min，1.34×104r·min－1離心 5 min，取上清進樣檢測。

1.6 方法學確證實驗

1.6.1 專屬性 比較空白血漿樣品（n＝6）與加藥血漿樣品以及給藥后血漿生物樣品的色譜圖，排除生物樣品中的內源性物質對DL0805-1和內標測定的影響。

1.6.2 標準曲線繪制與定量范圍確定 取空白血漿，加入系列濃度標準溶液，配制DL0805-1濃度為0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg·L－1的血漿樣品，按“1.5”項下方法處理，在相應的色譜條件下進行測定，重復5次。以DL0805-1峰面積（Ai）與內標峰面積（As）比值（Y）對 DL0805-1的濃度（X）進行線性回歸。

1.6.3 回收率

1.6.3.1 提取回收率 配制DL0805-1低、中、高3個濃度（0.625、5、20 mg·L－1）血漿樣品，按照“1.5”項下方法處理，進行 HPLC分析，記錄峰面積，與對應濃度標準溶液峰面積的比值，重復5次，計算提取回收率。

1.6.3.2 方法回收率 配制DL0805-1濃度為0.625、5和20 mg·L－1的血漿樣品，按照“1.5”項下方法處理，進行HPLC分析，記錄峰面積并計算Ai／As，帶入標準曲線得到DL0805-1的檢出量。檢出量與加入量的比值即為方法回收率。實驗重復5次。

1.6.4 精密度和準確度 配制DL0805-1 3個濃度的血漿樣品（0.625、5、20 mg·L－1）。樣品在 1 d內進樣5次（日內）或連續5 d進樣（日間）進行濃度測定，計算精密度與準確度。

1.6.5 穩定性 本實驗為了考察DL0805-1的穩定性，對3組血漿樣品進行了測定，實驗分組如下：（1）配制DL0805-1低、中、高3個濃度的血漿樣品，室溫放置4 h后處理；（2）血漿樣品處理后樣品盤放置24 h后測定；（3）血漿樣品在－20℃，反復凍融3次（每次冰凍24 h后室溫溶解）后處理測定。每組都包含 3個質量濃度（0.625、5、20 mg·L－1）的血漿樣品各5個，樣品按照“1.5”項下的空白血樣處理方法處理。

1.7 血漿生物樣品制備與測定 大鼠尾靜脈注射給藥：按5 mg·kg－1劑量尾靜脈注射給予DL0805-1。SD♂大鼠6只，禁食不禁水12 h。分別在給藥后 0.033、0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6和8 h眼內眥取血，肝素化管收集血樣，5 000 r·min－1、4℃離心10 min，分離得到血漿生物樣品，取血漿150μl，按“1.5”項下方法進行樣品處理與測定。計算DL0805-1尾靜脈注射后血藥濃度，繪制血藥濃度－時間曲線。

1.8 主要藥代動力學參數計算 采用DAS 3.0版數據處理系統對DL0805-1及其代謝產物的血藥濃度數據進行處理分析，計算藥代動力學參數（非房室模型法）。

2 結果

2.1 專屬性考察 在選定的色譜條件下，DL0805-1保留時間約為9.93 min，其代謝產物保留時間約為7.08 min，內標4-對乙酰氨基酚保留時間約為5.83 min，三者可以完全分離；血漿中內源性物質對三者的色譜峰沒有干擾（Fig 2 A－C）。

2.2 線性考察 實驗結果顯示，DL0805-1在0.313～40 mg·L－1濃度范圍內，線性回歸方程為＾Y＝0.3551 X－0.0067（n＝5），r2＝0.9999，線性范圍良好。定量限為0.313 mg·L－1。

2.3 回收率 實驗結果表明：DL0805-1在低、中、高3個濃度（0.625、5、20 mg·L－1）的血漿樣品提取回收率和方法回收率均在90%以上（Tab 1）。

2.4 精密度和準確度 DL0805-1的日內和日間精密度RSD均小于7%。結果表明該方法準確、可靠，滿足未知血漿樣品中藥物濃度分析的要求（Tab 2）。

2.5 穩定性 實驗結果顯示：DL0805-1的血漿生物樣品在經過不同方法處理后，樣品的RSD值均在10%以內（Tab 3）。表明樣品在保存和處理過程中均穩定，未發生明顯的降解。

Fig 2 Chromatograms of DL0805-1，metabolite of DL0805-1 and IS（4-acetaminophenol）

Tab 1 Recovery for DL0805-1 in rat plasma（n＝5）

Tab 2 Accuracy and inter-／intra-precision for DL0805-1 in rat plasma（n＝5）

Tab 3 Stability of DL0805-1 in rat plasma（RSD%，n＝5）

2.6 生物樣品檢測 大鼠尾靜脈給予DL0805-1后，于不同時間點眼內眥取血，用已建立的HPLC方法測定其血藥濃度。結果顯示，尾靜脈給藥后，可以檢測到原型藥物DL0805-1及其7 min處的色譜峰，初步判定7 min的色譜峰為DL0805-1在體內的代謝產物峰。DL0805-1藥 動 學 參 數：AUC（0－t）＝（2.38±0.80）mg·h·L－1，Tmax＝0.03 h，T1／2＝2.34±1.42）h，MRT（0－t）＝（2.00±0.48）h，Cmax＝（3.51±0.44）mg·L－1，CL＝（142.26±53.4）L·min－1·kg－1，代謝產物色譜峰面積相對 DL0805-1定量，得到藥動學參數為：AUC（0－t）＝（10.77±1.64）mg·h·L－1，Tmax＝（0.85±0.22）h，T1／2＝（1.27±0.45）h，MRT（0－t）＝（2.11±0.32）h，Cmax＝（3.55±0.22）mg·L－1，CL＝（30.93±5.13）L·min－1·kg－1，藥時曲線見 Fig 3。

Fig 3 Plasma concentration-time curves of metabolite（A）and DL0805-1（B）after intravenous injection of DL0805-1（ˉx±s，n＝6）

3 討論

實驗結果顯示，大鼠尾靜脈給予5 mg·kg－1的DL0805-1后，同時檢測到原型藥物及其代謝產物，DL0805-1的半衰期為（2.34±1.42）h，達峰濃度為（3.51±0.44）mg·L－1，清除率為（142.26±53.4）L·min－1·kg－1。其代謝產物相對DL0805-1的藥代參數：半衰期為（1.27±0.45）h，達峰濃度為（3.55±0.22）mg·L－1，清除率為（30.93±5.13）L·min－1·kg－1。可見，DL0805-1在大鼠體內迅速轉變成其代謝產物，且DL0805-1在體內滯留時間長，能很好地發揮生物學作用，但其代謝產物是否為活性產物有待進一步研究。

綜合以上結果，本研究建立了具有Rho激酶抑制活性的吲唑類新型化合物DL0805-1的體內血藥濃度檢測方法，經方法學研究確證，本法簡便、特異性好，精密度和準確度均滿足DL0805-1大鼠藥動學研究要求，可用于防治心血管系統疾病候選藥物DL0805-1的進一步研究和開發。

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