流動注射-化學發光法測定氯霉素

馬明陽

(西安文理學院化學與化學工程學院，陜西西安 710065)

氯霉素是世界上首種完全由合成方法大量制造的廣譜抗生素，對很多不同種類的微生物均起作用。它價錢低廉，廣泛用于治療各種敏感菌感染。但是，長期微量攝入氯霉素，不僅使沙門菌和大腸桿菌產生耐藥性，還會引起機體正常菌群失調，引發各種疾病，從而對人類健康構成潛在威脅。因此，對氯霉素的靈敏檢測具有十分重要的意義。

目前，測定氯霉素的方法主要有:高效液相色譜法［1-2］、氣相色譜法［3］、氣相色譜-質譜聯用法［4］、免疫法［5］、紫外分光光度法［6］、熒光法［7］和毛細管電泳法［8］等。實驗發現，氯霉素對H2O2-魯米諾化學發光體系有增敏作用，據此，結合流動注射分析，建立了靈敏檢測氯霉素的化學發光分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯霉素(中國藥品生物制品檢定所);魯米諾;NaOH、H2O2、KMnO4等均為分析純;蒸餾水。

IFFM-E型流動注射化學發光分析儀;IFFS-A型多功能化學發光檢測器。

1.2 溶液配制

1.2.1 魯米諾儲備液(1.0 ×10－2mol/L)的配制用10 mL 1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解1.77 g魯米諾，定容于1 000 mL容量瓶中作為儲備液，使用時用氫氧化鈉溶液稀釋至所需濃度。

1.2.2 標準溶液(1.00 ×10－3g/mL)的配制 準確稱取0.100 0 g氯霉素，用蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，使用時用水逐級稀釋至所需濃度。

1.3 實驗方法

流動注射化學發光反應裝置如圖1所示。a為待測液(藥品)，b為H2O2溶液，二者先混合，c為魯米諾溶液，流入進樣閥中，再與a、b混合液混合。三者流入流通池內，產生化學發光。采樣時間和進樣時間均為20 s，選擇高壓為500 V，泵速為30 r/min(進樣管內徑為0.8 mm，流路流速相當3 m/min)，以峰高進行定量。

圖1 流動注射化學發光分析儀流程圖Fig.1 Schematic diagram of CL flow system

2 結果與討論

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 流路選擇 可供選擇的流路有3種:①氯霉素和KMnO4先混合，再注入魯米諾(NaOH)溶液中;②氯霉素和魯米諾(NaOH)先混合，再注入KMnO4溶液中;③KMnO4和魯米諾(NaOH)先混合，再注入氯霉素溶液中。通過對以上流路的化學發光實驗，發現氯霉素在①中發光信號信噪比最大。因此，選定流路①作為流動注射發光實驗中的最佳流路。

2.1.2 氧化劑的選擇 對 KMnO4、H2O2、K2Cr2O7、K3Fe(CN)6逐一進行化學發光實驗，綜合考慮信噪比和樣品的相對發光強度兩個條件，確定H2O2為最佳氧化劑。

2.1.3 H2O2濃度的選擇 H2O2作為H2O2-魯米諾化學發光體系中的氧化劑，在 1×10－2～1×10－4mol/L范圍內，考察H2O2濃度對反應化學發光強度的影響，以最大信噪比作為依據。結果表明，H2O2最佳濃度為6.0 ×10－4mol/L。

2.1.4 魯米諾溶液中NaOH濃度的選擇 在堿性條件下，H2O2氧化魯米諾產生化學發光，介質的堿度影響化學發光法信號。考察了1.0×10－2～1.0×10－6mol/L范圍內NaOH的濃度對化學發光信號的影響。結果表明，當魯米諾中NaOH的濃度為8.0×10－5mol/L時，檢測到的化學發光具有最大的信噪比。

2.1.5 魯米諾濃度的選擇 魯米諾作為發光試劑，在1.0×10－3～1.0×10－6mol/L 范圍內考察了魯米諾濃度對體系化學發光信號的影響。結果表明，當濃度為1.0×10－4mol/L時，化學發光檢測具有最大的信噪比。

2.1.6 混合管長度的選擇 混合管的長度影響氯霉素和H2O2反應的完全程度，從而影響化學發光強度。若混合管太短，則氯霉素和H2O2反應不充分，混合管太長，則測量既費時間又費溶液。對混合管的長度在2～40 cm范圍內進行了選擇。以最大信噪比作為最佳長度判斷依據，選擇混合管長度為5 cm。

2.2 校準曲線、精密度和檢出限

在實驗選定的最佳條件下，為了提高測定的準確度，校準曲線分段繪制，氯霉素的質量濃度在2.0×10－7～8.0×10－6g/mL 范圍時，濃度與其發光強度呈良好的線性關系，校準曲線的基本參數列于表1。

表1 校準曲線的基本參數Table 1 The basic parameters of the calibration curve

11次平行測定5.0×10－7g/mL的氯霉素化學發光信號，方法的相對標準偏差為1.3%。方法的檢出限為5×10－8g/mL。

2.3 共存物質的影響

在優化的最佳實驗條件下，對5×10－7g/mL氯霉素進行干擾實驗。結果表明，相對誤差小于5%時，1 000倍的 N、淀粉不干擾，500 倍的 Cl－、S、葡萄糖、麥芽糖不干擾;100倍K+不干擾;等倍的C、Cu2+不干擾。

2.4 樣品分析

準確稱量10粒氯霉素膠囊，去皮后，稱取相當于1粒的量，用超純水溶解后定容至250 mL容量瓶中。準確移取一定體積該溶液，并用微孔濾膜過濾后稀釋至適宜濃度，用本方法定量測定膠囊中的氯霉素，同時做回收率實驗，結果見表2。

表2 氯霉素膠囊的測定結果和回收率Table 2 Determination results and recovery of chloramphenicol capsules

3 結論

基于氯霉素對H2O2-魯米諾化學發光體系的增敏作用，建立了流動注射化學發光分析方法檢測氯霉素的新方法。最佳實驗條件:流路選擇氯霉素和KMnO4先混合，再注入魯米諾(NaOH)溶液中;氧化劑選擇 H2O2，其濃度為 6.0 ×10－4mol/L;魯米諾中NaOH的濃度為 8.0×10－5mol/L;魯米諾濃度為1.0×10－4mol/L;選擇混合管長度為5 cm。在選擇的最佳條件下，該方法檢測氯霉素的檢出限(3σ)為5×10－8g/mL，對5×10－7g/mL氯霉素進行 11次平行測定，相對標準偏差(RSD)為1.3%，加標回收率在95%～105%。并用該方法對氯霉素膠囊中氯霉素的含量進行了測定。

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