三白草提取物對自由基的清除作用研究

劉曉欣，曹光群，劉學

(江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫 214122)

自從Dan Harman提出衰老的自由基學說和Me.Cord首先發現SOD并成功提取以來，研究人員開始關注自由基清除劑類皮膚抗衰老化妝品的研制和應用。這類化妝品能夠預防、減輕或延緩自由基對皮膚造成的老化作用，同時也深受廣大消費者的喜歡。按照目前國際通用分類方法，將自由基清除劑分為兩大類，即小分子和大分子自由基清除劑。除此之外，還有從植物中提取分離得到的具有自由基清除作用的活性物質，如某些黃酮類、三萜類、蔥醌類及茶多酚類的化合物。因此，從植物中尋找安全有效的天然抗氧化劑也是目前重要的研究課題之一。

三白草為三白草科多年生草本植物，別名塘邊藕、白花蓮等。三白草生于溝旁、沼澤等低濕處，主產江蘇、浙江等地，我國長江流域以南各省均有分布。三白草資源豐富，四季均可采。以全草入藥，具有利尿消腫，清熱解毒之功效，也可用于小便不利、淋瀝澀痛、白帶異常、外治瘡瘍腫毒和濕疹等［1-2］。三白草主要化學成分為揮發油、木脂素類、黃酮類、生物堿類化合物［3］，具有明顯的降糖、抑瘤、抗炎、保肝以及抗氧化等作用［4-6］。

本實驗采用三種方法，考察了三白草乙醇提取物經不同溶劑萃取所得的各部分對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力，以BHT為參考。實驗結果顯示，三白草乙醇提取物經不同溶劑萃取所得的各部分對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基都具有清除能力，且隨著提取物濃度增加，清除能力逐漸增高;其中所得的乙酸乙酯萃取部分對這3種自由基的清除作用最強。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三白草，購自無錫中藥店;乙醇、石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、六水合硫酸亞鐵銨、濃鹽酸、鄰二氮菲、過氧化氫均為分析純;DPPH、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為生物試劑;BHT，化學純。

DFY-300型300 g搖擺式高速萬能粉碎機;SHB-III型循環水式多用真空泵;W201型恒溫水浴鍋;“弘祥隆”CTXNW-2B型超聲循環提取機;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 三白草有效成分的提取 稱取三白草粉末100 g，按料液比加入70%乙醇溶液1.8 L，于50℃超聲提取50 min，抽濾，減壓回收溶劑，真空干燥，得三白草乙醇提取物粉末。

1.2.2 三白草溶劑萃取物的制備 將三白草乙醇提取物粉末溶于去離子水，得到水懸液，搖勻，倒入500 mL分液漏斗中。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進行多次萃取。各萃取部分的溶液再經減壓蒸餾，回收各萃取劑，從而分別得到各萃取部分的濃縮物。各濃縮物用70%乙醇配制成不同濃度的溶液，備用。

1.3 清除自由基能力測定

1.3.1 清除DPPH自由基的能力測定［7］用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將2 mL無水乙醇溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min，測定其吸光度A0，同樣的方法，測定2 mL DPPH溶液與2 mL待測樣品溶液(或BHT溶液)混合后的吸光度A1，以及2 mL測試樣品溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度 A2。

1.3.2 清除羥基自由基的能力測定［8］實驗中取8支試管，編號1～8。先向1～8號試管中，依次加入0.3 mL 鄰二氮菲溶液(濃度 7.5 mmol/L)、1 mL Tris-HCl緩沖劑(pH=7.47)和0.3 mL 硫酸亞鐵銨溶液(濃度7.5 mmol/L)，充分搖勻。再向1～6號試管中加入0.3 mL不同濃度的待測樣品溶液(或BHT溶液)。向7號試管中加入0.2 mL H2O2溶液(體積分數1.8%)，8號試管中既不加樣品，也不加H2O2溶液，最后用去離子水定容。在37℃恒溫水浴中保溫反應1 h，光譜掃描后，在最大吸收波長510 nm處測量吸光度。

式中 B1——加入待測樣品的羥基自由基體系的吸光值;

B2——不加H2O2體系的吸光值;

B3——加入H2O2體系的吸光值。

1.3.3 清除超氧自由基的能力測定［9］取7支試管，先依次加入5 mL Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液。在1～6號試管中，再依次加入0.3 mL不同濃度的待測樣品溶液(或BHT溶液)。7號試管中加入0.3 mL去離子水，作為空白對照，即鄰苯三酚自氧化率。在37℃恒溫條件下，水浴20 min，再加入0.3 mL 7.5 mmol/L鄰苯三酚溶液。快速搖勻，5 min內，每30 s，在320 nm處測吸光度。最后，計算吸光度隨時間的變化率。

式中，C1和C2分別表示空白溶液和樣品溶液的吸光度隨時間的變化率。

2 結果與討論

2.1 三白草乙醇提取物及溶劑萃取物的得率

三白草乙醇提取物及溶劑萃取物的得率見表1。

表1 三白草乙醇提物及溶劑萃取物的得率Table 1 Extraction rate of ethanol extract and various fractions of Saururus by extracting

2.2 清除DPPH自由基的能力

分別測定了三白草乙醇提取物經石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對DPPH自由基的清除作用，結果見圖1。

圖1 三白草提取物各萃取部分對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on DPPH free radical

由圖1可知，三白草乙醇提物各萃取部分對DPPH自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強。各萃取部分對DPPH自由基的清除能力為:乙酸乙酯層 ＞正丁醇層 ＞氯仿層 ＞石油醚層。其中乙酸乙酯萃取部分對DPPH自由基的清除能力相對最強，當濃度在50 mg/L時，對DPPH自由基的清除率為90.02%。

2.3 清除羥基自由基的能力

分別測定了三白草乙醇提取物經石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對·OH自由基的清除作用，結果見圖2。

圖2 三白草提取物各萃取部分對羥基自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on·OH free radical

由圖2可知，三白草乙醇提物各萃取部分對·OH自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強。各部分對·OH自由基的清除能力為:乙酸乙酯層 ＞正丁醇層 ＞石油醚層 ＞氯仿層。其中乙酸乙酯萃取部分對·OH自由基的清除能力相對最強，當濃度在50 mg/L時，對羥基自由基的清除率為45.12%。

2.4 清除超氧自由基的能力

分別測定了三白草乙醇提取物經石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對超氧自由基的清除作用，結果見圖3。

圖3 三白草提取物各萃取部分對超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on O2－·free radical

由圖3可知，三白草乙醇提物各萃取部分對超氧自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強。各部分對超氧自由基的清除能力為:乙酸乙酯層＞正丁醇層＞氯仿層＞石油醚層。其中乙酸乙酯萃取部分對超氧自由基的清除能力相對最強，當濃度在1.0 mg/L時，對超氧自由基的清除率為74.11%。

3 結論

(1)三白草乙醇提取物的各萃取部分都具有清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的能力，隨萃取物的濃度增加，清除能力增強。

(2)三白草乙醇提取物的各萃取部分對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力存在差異。可能是因為不同極性的萃取溶劑對活性物質的溶解度不同，所得到的活性物質存在數量和種類上的差異。

(3)三白草乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力相對最強。三白草中含有黃酮類物質，而這類物質往往具有抗氧化性能。可能是因為乙酸乙酯溶劑與該類物質的溶解度更為接近，因而萃取得到大部分的活性物質。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學工業出版社，2005.

［2］王建新.化妝品植物原料大全［M］.北京:中國紡織出版社，2012.

［3］彭冰，何春年，許利嘉，等.三白草的化學成分研究［J］.中草藥，2010，41(12):1950-1952.

［4］何亞維，彭國平，黃秀泉，等.三白草降血糖作用的研究［J］.中國中藥雜志，1992，17(12):751-752.

［5］郭凌霄，蘇國生.三白草提取物抑瘤作用研究［J］.國家檢驗醫學雜志，2010，33(6):643-647.

［6］李澤友，陳峰，任守忠，等.三白草的化學成分和藥理作用研究進展［J］.中國藥房，2007，18(6):472-474.

［7］方玉梅，譚萍，王毅紅，等.金針菇黃酮類化合物清除DPPH自由基活性［J］.食品研究與開發，2012，27(6):8-10.

［8］趙二勞，張海容，蓋青青，等.沙棘黃酮的測定及其抗氧化作用［J］.化學研究與應用，2003，15(2):284-285.

［9］梁麗麗，曹光群，曾蘭蘭，等.中藥地榆提取物對自由基的清除作用［J］.天然產物研究與開發，2008，20:511-513.