湖北海棠葉水煎劑對HSV-1病毒性結(jié)膜炎治療作用

李祖銘,孔麗華,余玲,王青,黃朝明,席祖蓮,屈克義,李建蓉

(1.湖北省宜昌市夷陵區(qū)婦幼保健院,宜昌 443100;2.湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院,宜昌 443100;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,武漢 430030)

湖北海棠葉水煎劑對HSV-1病毒性結(jié)膜炎治療作用

李祖銘1,孔麗華1,余玲1,王青1,黃朝明1,席祖蓮2,屈克義2,李建蓉3

(1.湖北省宜昌市夷陵區(qū)婦幼保健院,宜昌 443100;2.湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院,宜昌 443100;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,武漢 430030)

目的 研究湖北海棠葉水煎劑對I型單純皰疹病毒(HSV-1)所致結(jié)膜炎的治療作用。方法采用湖北海棠葉水煎劑作為實驗樣品,用利巴韋林滴眼劑作對照。分別以HSV-1感染Vero細(xì)胞和家兔眼結(jié)膜,通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)判斷藥物抑制病毒復(fù)制的環(huán)節(jié)。對家兔眼結(jié)膜炎疾病模型進(jìn)行眼結(jié)膜組織病理學(xué)檢查,觀察低、中、高濃度湖北海棠葉水煎劑對HSV-1兔眼結(jié)膜炎的治療作用。結(jié)果體外實驗中,湖北海棠葉水煎劑對HSV-1增殖無抑制作用。整體動物實驗中,眼部給予湖北海棠葉水煎劑3,6 kg·L-1,連續(xù)給藥7 d,家兔眼結(jié)膜病理性炎癥反應(yīng)明顯減弱甚至消失,與0.9%氯化鈉溶液對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中、高劑量組家兔眼結(jié)膜炎治療有效率分別為83.3%和100.0%。結(jié)論湖北海棠葉水煎劑可減輕HSV-1所致家兔結(jié)膜炎炎性反應(yīng)。

湖北海棠葉;結(jié)膜炎,病毒性;抗病毒作用

結(jié)膜炎是眼科常見病,結(jié)膜炎的病因主要分為感染性和非感染性,而感染性結(jié)膜炎的病原體主要包括病毒、細(xì)菌和衣原體等。湖北海棠含有茶多酚、黃酮、鋅(Zn)、鎘(Cr)、錳(Mn)等多種礦物質(zhì),具有抗菌消炎、耐缺氧、抗疲勞、降血糖等多種藥理作用[1-2]。湖北宜昌民間常用湖北海棠葉煎液治療急性結(jié)膜炎,筆者前期研究發(fā)現(xiàn),湖北海棠葉煎液具有一定的抗菌作用,在此基礎(chǔ)上,筆者在本實驗將進(jìn)一步探討湖北海棠葉對I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1, HSV-1)所致病毒性結(jié)膜炎的治療效果,以期為該藥的開發(fā)、應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥 湖北海棠葉(采自湖北省宜昌市夷陵區(qū),經(jīng)宜昌市夷陵醫(yī)院李文勝主任藥師鑒定為薔薇科植物湖北海棠Malus hupehensis),稱取新鮮干燥湖北海棠葉1,3,6 kg,分別用純化水2 L浸泡24 h,煎煮,過濾,去渣,濃縮至100 mL,相當(dāng)各生藥含量為1,3, 6 kg·L-1水煎劑,置冰箱內(nèi)供實驗用。利巴韋林滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限公司生產(chǎn),利巴韋林含量1 g·L-1,批號:12030701)。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's MediumDMEM,賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);胰酶(美國Gibco公司);噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazoliumbromide,MTT,美國Biosharp公司)等。

1.2 儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療有限公司),二級生物安全柜(新加坡ESCO),倒置顯微鏡(日本奧林巴斯),酶標(biāo)儀(美國THERMO)等。

1.3 實驗用病毒及其活力測定 HSV-1由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒研究所提供,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系傳代后低溫保存,備用。細(xì)胞株: Vero細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供;病毒滴度的測定:將不同濃度的各病毒液接種于相應(yīng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)物中,測定引起50%細(xì)胞病變的組織細(xì)胞感染劑量(50%tissue culture-infective dose,TCID50)[3]。Vero細(xì)胞接種HSV-1后50 h出現(xiàn)圓縮、死亡和脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)。

1.4 細(xì)胞毒性測定 正常對照組:加等量不含任何藥物細(xì)胞維持液;藥物處理組:分別將1×108·L-1Vero細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL,37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h,生長成單層細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,分別加入含不同濃度(終濃度分別為0.5,1,2,4, 8,16,32,64,128,256 g·L-1)湖北海棠葉水煎劑及利巴韋林的細(xì)胞維持液200 μL,陽性藥對照組:利巴韋林終濃度分別為0.5,1,2,4,8,16,32,64,128, 256 mg·L-1,各10個濃度梯度。各濃度實驗藥,對照藥及正常細(xì)胞對照均設(shè)復(fù)孔3個。培養(yǎng)72 h后,觀察CPE情況;并用MTT比色法檢測細(xì)胞活性,計算存活細(xì)胞百分比[4]。按Reed-Meuench法計算藥物對細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(50%Cytotoxic concentration,CC50,單位:g·L-1)[5]。

1.5 體外抗病毒實驗 將100個TCID50/mL滴度的病毒與上述各濃度的湖北海棠葉煎劑4℃作用6 h,反應(yīng)體系為200 μL,即100 μL的TCID50100個·mL-1滴度的病毒和100 μL的藥物,然后將混合液放于單層細(xì)胞,孵育2 h,換用細(xì)胞維持液繼續(xù)細(xì)胞生長。37℃CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d,每天連續(xù)觀察CPE。按文獻(xiàn)[6]計算存活細(xì)胞的百分比及藥物抗病毒半數(shù)有效濃度(effective concentration,EC50)。

1.6 實驗動物與病毒性眼結(jié)膜炎模型的制備 普通級新西蘭家兔,體質(zhì)量2.0～2.5 kg,30只(60只眼),雌雄各半,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,動物使用許可證號:SYXK(鄂)2012-0028。兔眼結(jié)膜炎的制備:在家兔雙眼內(nèi)滴2%利多卡因表面麻醉后,在上眼瞼結(jié)膜表面作“#”劃痕,取1∶5稀釋的HSV-1液[該濃度比是引起100%家兔眼結(jié)膜病變的最低劑量,100%最低光毒性劑量(minimal phototoxic dose,MPD)]100 μL接種于劃痕處,輕揉眼瞼1 min,將兔放置兔籠內(nèi)正常喂養(yǎng),每天定時觀察家兔眼結(jié)膜病變并記錄。

1.7 動物分組及藥物處理 成年健康家兔30只,雌雄各半,采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分組,共分為5組,即病毒感染模型對照組,病毒感染+湖北海棠葉水煎劑3個劑量組,陽性對照組,每組6只。除模型對照組外,其他各組兔眼在病毒感染后24 h分別雙眼內(nèi)滴入海棠葉水煎劑(濃度為1,3,6 kg·L-1)或利巴韋林滴眼劑50 μL,病毒感染模型對照組兔眼滴入等量滅菌0.9%氯化鈉溶液,以上各組動物每天用藥2次,連續(xù)給藥7 d。用藥期間每天觀察兔眼病情,根據(jù)文獻(xiàn)按結(jié)膜充血和水腫等臨床癥狀將病情分為輕、中、重3級[7]。實驗結(jié)束后分別取各組家兔雙眼瞼組織,用10%甲醛固定后切片,蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,進(jìn)行病理學(xué)檢查。根據(jù)病理檢查評價藥物的療效,結(jié)果判定為治愈、顯效、改善、無效。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 用SAS6.12統(tǒng)計軟件處理,組間差異顯著性比較采用Χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抗病毒作用 正常對照組細(xì)胞無CPE, 100TCID50濃度的病毒作用細(xì)胞后約3 d出現(xiàn)明顯CPE。在無細(xì)胞毒濃度范圍內(nèi)將湖北海棠葉水煎劑進(jìn)行倍比稀釋,MTT法檢測其對HSV-1引起的細(xì)胞病變的抑制。湖北海棠葉水煎劑不同濃度組均出現(xiàn)典型病毒感染所致的CPE,且與病毒對照孔無顯著區(qū)別,表明湖北海棠葉無直接殺滅病毒作用。在抑制病毒生物合成實驗中,湖北海棠葉無明顯抑制HSV-1在細(xì)胞內(nèi)生物合成作用。

2.2 對HSV-1兔眼結(jié)膜炎的治療作用 抗HSV-1病毒性結(jié)膜炎實驗結(jié)果見表1。HSV-1感染后,模型對照組6只兔(12只眼),其中10只眼發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng),2只眼發(fā)生中度改變,經(jīng)湖北海棠葉水煎劑(1,3, 6 kg·L-1)處理后,病變程度明顯減輕,有效率分別為50.0%,83.3%,100.0%,療效與劑量之間存在一定的量效關(guān)系,在模型對照組可觀察到家兔結(jié)膜充血、水腫明顯,7 d后50%可自愈。湖北海棠葉水煎劑低劑量組的療效與模型對照組相當(dāng),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),而中劑量組和高劑量組治愈率分別為83.3%,100.0%,與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),高劑量組的療效略優(yōu)于陽性對照組。結(jié)果見表1。

2.3 對HSV-1兔眼結(jié)膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響 見圖1。未感染HSV-1家兔僅局部眼結(jié)膜可見少量淋巴細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞,HSV-1感染家兔結(jié)膜炎主要表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞浸潤,淋巴濾泡形成,經(jīng)湖北海棠葉水煎劑滴眼治療顯效的HSV-1感染家兔結(jié)膜炎標(biāo)本炎性細(xì)胞浸潤,血管充血和組織水腫均有顯著改善。

3 討論

湖北海棠又名野海棠、野花紅、花紅茶、茶海棠,屬薔薇科蘋果屬落葉喬木,其嫩葉曬干可作茶葉飲用。湖北海棠有抗植物病毒的作用,其中的黃酮類化合物抗病毒活性較強(qiáng),根皮苷是湖北海棠的主要成分,也有抗病毒作用[8]。目前臨床用于預(yù)防或治療病毒性眼結(jié)膜炎的藥物主要為抗菌藥物和抗病毒藥物,近幾年應(yīng)用以中藥為原料的防治病毒性眼結(jié)膜炎藥物也有較多報道,并且在治療單純皰疹病毒感染性疾病已取得較好療效。

HSV-1感染正常家兔眼結(jié)膜后,可制備出實驗性家兔眼結(jié)膜炎模型。HSV-1感染家兔眼結(jié)膜主要病理變化為淋巴細(xì)胞浸潤,淋巴濾泡的形成。而濾泡的多少與炎癥反應(yīng)強(qiáng)度呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果證實,1,3和6 kg·L-1湖北海棠葉水煎液治療HSV-1感染實驗性家兔眼結(jié)膜炎的有效率依次增高,中高劑量組療效等于或優(yōu)于利巴韋林,提示湖北海棠葉具有治療實驗性病毒結(jié)膜炎的作用。

表1 5組家兔眼結(jié)膜炎療效結(jié)果Tab.1 Efficacy on conjunctivitis of five groups of rabbits 只

A.正常對照組;B.模型對照組;C.湖北海棠葉水煎劑高劑量組圖1 3組家兔眼結(jié)膜病理切片(×100)A.normal control group;B.model control group;C.high-dose MHD-treated groupFig.1 Pathological examination on eye conjunctiva in three groups of rabbits(×100)

抗病毒的藥物主要通過兩個方面發(fā)揮作用,一方面抑制病毒復(fù)制(滅活、吸附、生物合成等)的各個環(huán)節(jié),干擾病毒的生長;另一方面是提高機(jī)體免疫防御能力,減輕局部炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示:湖北海棠葉水煎劑對體外培養(yǎng)的HSV-1病毒的增殖無抑制作用,但對該病毒感染所致的結(jié)膜炎,則可明顯減輕其炎癥反應(yīng),減輕組織病理損傷,具有良好的治療效果。

[1] 屈克義,胡漢環(huán),杜遠(yuǎn)義,等.湖北海棠葉煎液藥效學(xué)實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2000,11(2):107-108.

[2] 方榮,楊茜,李莉,等.湖北海棠中根皮苷含量測定[J].食品科技,2008,6(2):195-196.

[3] FRIDHOLMH,EVERITT E.Rapid reproducible infectivity end-point titration of virulent phage in a microplate system[J].J Virol Methods,2005,128(1-2):67-71.

[4] 楊佃志,張永萍.復(fù)方大果木姜子乳膏體外抗HSV-1病毒的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(5):1154-1155.

[5] LIN Y J,CHANG Y C,HSIAO N W,et al.Fisetin and rutin as 3C protease inhibitors of enterovirus A71[J].J Virol Methods,2012,182(1-2):93-98.

[6] 劉瑩,王國麗.金銀花提取物對單純皰疹病毒性角膜炎的作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,30(11):1421-1424.

[7] 葛堅.眼科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:94.

[8] 汪鋆植,葉建武,余青,等.湖北海棠抗大蒜病毒活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(8):3314-3315.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.006

Efficacy of Hubei Wingnut(Malus hapehensis)Leaf Decoction on Viral Conjunctivitis Infected with HSV-1

LI Zu-ming1,KONG Li-hua1,YU Ling1,WANG Qing1,HUANG Chao-ming1,XI Zu-lian2,QU Ke-yi2,LI Jianrong3
(1.Yiling Maternal and Child Health Hospital of Yichang City,Yichang 443100,China;2.Yiling Hospital of Yichang City,Yichang 443100,China;3.Department of Pathogenic Microorganism,School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of theHubeiWingnut(Malus hapehensis)leaf decoction (MHD)against conjunctivitis infected with human simplex virus type I(HSV-1).MethodsMalus hupehcnsisdecoction was used as the active treatment and ribavirin(RBV)eye drop was used as the positive control.Both of the Vero cells and rabbit eyeconjunctiva were infected with HSV-1.The effect and mechanismof the MHD on viral replication was determined by observing the cytopathic effect(CPE).The efficacy of MHD at different doses on the rabbit viral conjunctivitis was examined by pathological changes of eye conjunctiva tissues.ResultsMHD did not inhibit the proliferation of HSV-1in vitro.The inflammatory reactions of rabbit viral conjunctivitis caused by HSV-1 were obviously attenuated or disappeared after treatment with MHD at 6 kg·L-1and 3 kg·L-1for 7 consecutive days,compared with the negative control of 0.9%NaCl.The curative rate of MHD at the middle and high doses was 83.3%and 100.0%,respectively.ConclusionMHD has the potential for treating eye conjunctivitis caused by HSV-1 by relieving inflammation.

HubeiWingnut(Malus hapehensis)leaf;Conjunctivitis,viral;Anti-viral effect

R285.5;R965

A

1004-0781(2014)07-0862-04

2013-06-24

2013-08-20

李祖銘(1971-),男,湖北宜昌人,副主任技師,學(xué)士,主要研究方向:臨床病原體實驗室診斷。E-mail: lizumingyichang@126.com。

孔麗華(1967-),女,湖北宜昌人,副主任醫(yī)師,學(xué)士,主要研究方向:兒童微生物檢驗。E-mail:klhycyl@126. com。