毛細管固相微萃取-液質聯用測定血漿中5種新型濫用藥物*

王毅,劉子秋

(貴陽市公安司法鑒定中心,貴陽 550007)

毛細管固相微萃取-液質聯用測定血漿中5種新型濫用藥物*

王毅,劉子秋

(貴陽市公安司法鑒定中心,貴陽 550007)

目的 建立毛細管固相微萃取-超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法測定血漿中新型濫用藥物。方法取含藥物成分的血漿樣品1 m L,加入硼砂緩沖液2 mL后吸入注射器中,與內壁固定有DB-1701毛細管柱的不銹鋼針頭連接,置于注射泵,以300μL·min-1流速排出樣品,乙腈50μL洗脫2min,采用UPLC-MS/MS梯度洗脫-正離子多反應監測掃描測定洗脫液中藥物成分,并對實際樣品進行檢驗。結果血漿中鹽酸可待因、鹽酸曲馬多、地芬諾酯、地西泮、三唑侖等5種新型濫用藥物回收率為69.2%～81.7%,RSD＜10%,檢測限＜25 ng·mL-1,26例樣品中檢出7例。結論采用毛細管固相微萃取方法簡便,快速,與UPLC-MS/MS技術結合可用于血漿中新型濫用藥物的快速篩查。

毛細管固相微萃取;液質聯用;濫用藥物,新型;血漿

止咳水、鹽酸曲馬多片、復方地芬諾酯片處方制劑中主要含有可待因、曲馬多、地芬諾酯等精神類藥物成分,近年來在青少年中濫用的情況越發嚴重,首用年齡由16歲降至約14.5歲,合并地西泮、三唑侖使用更易造成依賴,甚至死亡。對血漿中該類新型濫用藥物的篩查分析已成為法醫毒物檢驗的新關注點[1]。現有檢驗方法例如液-液提取[2]、固相萃取法[3]所耗時間長、有機試劑用量大、成本高。而毛細管固相微萃取(in-tube solid-phasemicroextraction,In-tube SPME)技術操作簡便、快捷,污染小[4],便于在線聯用[5-6],在藥物篩查方面具有良好的應用前景。筆者通過建立In-tube SPME-超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯用法測定血漿中新型濫用藥物,并對實際樣品進行檢驗,以提高檢測效率和準確度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UPLC-TQD三重四級桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛細管色譜柱(美國J&W公司)；實驗室注射泵(LSP01-1A,蘭格公司)；20-gauge不銹鋼針頭,魯爾頭進樣器(上海光正醫療儀器有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸可待因、鹽酸曲馬多、地芬諾酯、地西泮、三唑侖標準品(公安部物證鑒定中心)；內標為3,4-亞甲二氧甲基苯丙胺(DL-3,4-methylenedioxymethamphetamine,DLMDMA,美國Aldrich公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)；超純水。

2 方法與結果

2.1 標準溶液制備 準確稱取標準品和內標,分別用甲醇配制成1 mg·m L-1標準儲備液,然后稀釋配制成20μg·m L-1的混合標準品溶液。

2.2 樣品溶液制備 取空白血漿,添加適量混合標準品溶液,制得藥物濃度為100 ng·mL-1的混標血漿樣品；In-tube SPME裝置的不銹鋼針頭內表面依次用1 mol·L-1鹽酸、乙腈清洗。截取10 cm毛細管柱,表面涂布環氧膠,放入不銹鋼管內,制得In-tube SPME針頭,晾干4 h后備用。

萃取:取血漿1 m L,加入緩沖液2 mL,漩渦混勻,離心,注射器抽取上清液后更換In-tube SPME針頭,置于注射泵以一定流速排出樣品,完成萃取過程。

解吸:用水1 m L洗去In-tube SPME針頭中殘留樣品后,針頭換至含乙腈50μL的魯爾頭進樣器上,置于注射泵以一定流速排出乙腈,使目標物從固定相中洗脫出來,完成解吸。

2.3 測定條件 Waters UPLC-TQD；色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm),柱溫:30℃,流動相:乙腈(A相)-0.1%甲酸(B相)梯度洗脫,梯度洗脫程序:A相5%保持2 min,從5%經15 min升至25%,再從25%經3 min升至100%,保持1.5 min；流速:0.3mL·min-1；進樣體積5μL。質譜條件:采用電噴霧電離源,毛細管電離電壓:3 kV,離子源溫度: 120℃；噴霧氣與反吹氣:氮氣,去溶劑氣流速: 650 L·h-1,多反應離子監測。

2.4 萃取條件優化

2.4.1 毛細管萃取柱的選擇 不同填料對血漿中藥物成分的萃取能力不同,實驗在一定條件下對DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛細管柱的萃取效率進行考察,結果(圖1A)表明DB-1701色譜柱表現出最優的效果。

2.4.2 基底pH影響 實驗考察了5種pH(間隔1.5)基底對樣品萃取效率影響(pH＞9時環氧膠易漏液,不作考慮)。結果(圖1B)表明,在pH8.5基底環境下效率最佳。

2.4.3 萃取流速的考察 為考察不同流速對萃取效率的影響,實驗采用100,300,500μL·min-13個流速進行考察,結果(圖1C)顯示實驗范圍內流速變化對萃取效率的影響并不顯著,實驗選用300μL·min-1作為萃取流速。

A.毛細管萃取柱的選擇;B.pH優化;C.流速優化;D.解吸時間優化圖1 毛細管固相微萃取條件優化A.the optimization of capillary-column；B.optimization of sample pH on extraction efficiency；C.optimization of flow rate；D. optimization of desorption timeFig.1 Optim ization of extract condition of in-tube SPME

2.4.4 解吸時間的考察 In-tube SPME僅使用數微升有機溶劑即可完成萃取,實驗采用50μL乙 腈在5個不同時間段對解吸效率進行考察,曲線表明(峰面積按比例縮小),在1～2 min時提取效率大幅增加,但在2 min后無明顯變化(圖1D)。

2.5 專屬性 取空白血500μL,按“2.2”項操作,獲得空白樣品多重反應檢測(multiple reactionmonitoring, MRM)提取色譜圖2A；取混標血漿樣品,同法操作獲得混標添加MRM提取色譜圖2B。結果表明血中內源性物質不干擾待測成分測定。

A.空白溶液;B.樣品溶液圖2 兩種溶液的In-tube SPME-UPLC-MS/MS色譜圖A.blank solution；B.sample solutionFig.2 Chrom atogram of in-tube SPME-UPLC-MS/MS for two k inds of solutions

2.6 加樣回收率實驗 取混標血漿樣品(n=6),按“2.2”項操作,獲得相應峰面積(A樣)；另取全血樣品,同法操作,獲得空白基質溶液,加入相同濃度的標準工作液,進樣分析獲得相應峰面積(B樣)；以A樣與B樣峰面積之比計算提取回收率,結果見表1,藥物回收率69.2%～81.7%。

2.7 方法檢測限 配制質量濃度逐漸降低的系列人血樣品,按“2.2”項方法操作后進樣分析,記錄峰面積,測得藥物檢測限(S/N=3),結果顯示(表1)均低于國際法庭毒理協會報告數據。

2.8 重復性 取混標血漿樣品(n=6),按“2.2”項下操作,測定峰面積并計算,結果RSD＜10%,說明方法重復性良好。

2.9 樣品測定 對26例非正常死亡青少年血漿進行濫用藥物篩查,檢出7例(表2),其中3例在服用藥物后1 h內發生死亡,其余4例均發生在1～3 h,血漿篩查結果表明混合服用藥物可能是造成迅速死亡的直接原因。

3 討論

色譜柱常用內徑分別為0.25,0.32,0.53 mm,內部容積分別為4.91,8.04,20.58μL,選用容積較小的毛細管在一定流速下可以減少管壁液膜層厚度,在非平衡動態吸附方式下對萃取富集和解吸洗脫均有良好效果；且固定相萃取量與血漿中目標物濃度存在線性關系,與血漿體積無關,則固定相厚度增加,萃取量增加,但當厚度接近1μm時,可觀察到殘留增加,選用膜厚0.5μm為佳。

實驗中對于萃取流速考察與FAN等[7]的研究結果相反。考慮雖然增加流速,導致柱體內“對流”效應上升,從而使血漿通過管體時湍流雷諾數加大,但不同大小分子的擴散速度不同,此時萃取效率僅與液膜表面作用力和液膜下固定相表面吸附力有關,因此流速增大未改變萃取效率。另外,500μL·min-1產生明顯氣泡,故實驗選用300μL·min-1作為萃取流速。

受毛細管內壁填料絕對量影響,In-tube SPME不具備良好的線性關系,目前研究多為定性篩查使用[8],實驗未對線性進行考察。且當樣本濃度＞200 ng·mL-1時可觀察到地芬諾酯、地西泮、三唑侖發生明顯“泄漏”,采用100 ng·mL-1濃度進行回收率考察等實驗內容符合國際毒理學家協會(The International Association of Forensic Toxicologists,TIAFT)要求。

表1 血漿中藥物回收率、相對保留時間及檢測限Tab.1 Recoveries of drugs in p lasma and their relative retention tim e(RRT)and LOD n=6

表2 7例非正常死亡青少年血漿樣品篩查結果Tab.2 Determ ination result of p lasma sam p le from seven youngsters of abnormal death

In-tube SPME技術近來發展很快,結合UPLC-MS/ MS對血漿中新型濫用藥物進行篩查,相比其他方法[2],環境友好,操作簡便,易自動化,且方法回收率及重復性良好[9],可運用于實際案例篩查分析。在將來的工作中采用該方法進一步擴大藥物篩查范圍,將成為法醫毒物檢驗的常用手段。

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.007

Determination of 5 New Abused Drugs in Plasma by In-tube Solid-phase Microextraction Coupled to Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yi,LIU Zi-qiu
(Judicial Expertise Center ofGuiyang Public Security Bureau,Guiyang 550007,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of new abused drugs in plasma by using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)combined with in-tube solid-phase microextraction.Methods2mL of borax bufferwasadded to1mLofplasmawith drugs.Then,themixturewaswithdrawn into a syringe connected to a stainless steel needle welded with DB-1701 capillary column.50μL acetonitrile was used as elution solventat the flow rate of 300μL·min-1for 2min.Subsequently,the drugs on elutewere determined by using UPLC-MS/MS in positivemodewithmultiple reactionmonitoring(MRM)to determine drug concentration in human plasma samples.ResultsThe recoveries rates of the five abused drugs(codeine hydrochloride,tramadol,diphenoxylate hydrochloride,diazepam,and triazolam)in plasma were between 69.2%-81.7%with the RSDs less than 10%.LODs of the drugs were less than 25 ng·mL-1.Seven out of the 26 plasma samples were determ ined positive.ConclusionThe in-tube SPME method coupled to UPLC-MS/MS is simple,rapid,and environmental friendly,which is suitable for the the rapid screening of the new abused drugs.

In-tube solid-phase microextraction;Liquid chromatography tandem mass spectrometry;Abused drugs, new type;Plasma

R971;R969.1

A

1004-0781(2014)05-0575-04

2013-07-10

2013-09-21

*貴陽市科技計劃項目:筑科合同[2012103]98號；貴州省優秀科技教育人才省長專項資金項目[(2011)23號]

王毅(1982-),男,湖南長沙人,工程師,碩士,從事法醫毒物檢驗工作。電話:0851-6797740,E-mail:18712664@qq.com。