CRP在小鼠肺炎支原體肺炎模型中的表達及相關(guān)機制的研究

胡起波，許 忠，高 航，潘 薇，車廣華＊

CRP在小鼠肺炎支原體肺炎模型中的表達及相關(guān)機制的研究

胡起波1，許 忠1，高 航2，潘 薇1，車廣華1＊

（1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院兒科，吉林長春130041；2．吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點實驗室，吉林長春130021）

目的 探討CRP在小鼠肺炎支原體肺炎模型中的表達及相關(guān)作用機制。方法 建立小鼠肺炎支原體肺炎模型，分為對照組、模型組、治療組，每組8只，按時間點處死后留取血清、肺及其他臟器組織，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法、免疫組織化學(xué)技術(shù)及RT－PCR方法檢測對照組、模型組、治療組CRP的表達。采用SPSS11．5軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果 CRP在肺炎支原體肺炎的肺組織中呈高表達，與正常組、治療組比較差異具有顯著性（P＜0．05）。CRP在有肺外炎癥的陽性表達強度明顯高于無肺外炎癥的組織中的表達，差異有顯著性（P＜0．05）。酶聯(lián)免疫法、免疫組織化學(xué)檢測CRP蛋白陽性表達結(jié)果與RT－PCR的方法檢測結(jié)果一致。結(jié)論 CRP在肺炎支原體肺炎中的表達高于其在正常組、治療組中的表達；其陽性表達強度與肺炎支原體肺炎的炎癥程度有關(guān)。CRP在有肺外炎癥的陽性表達強度明顯高于無肺外炎癥的組織中的表達。CRP有可能參與了肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展過程，為其診斷、肺外炎癥的提示及合理治療提供依據(jù)。

C反應(yīng)蛋白；肺炎支原體肺炎；機制；小鼠

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0183）

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是由肺炎支原體（MP）引起的肺部炎癥，是一種常見的兒童獲得性肺炎。近年來，肺炎支原體肺炎的發(fā)病率有明顯增加的趨勢。肺炎支原體是介于細菌和病毒之間的病原體，肺炎支原體在引起肺炎的同時也會導(dǎo)致各種肺外并發(fā)癥，如腦炎、心肌炎、肝炎以及造血系統(tǒng)疾病等，已引起臨床醫(yī)師的高度重視。CRP是一種急性時相蛋白，因CRP不受性別、年齡、貧血和高球蛋白血癥等因素影響，所以優(yōu)于其他急性期反應(yīng)物質(zhì)。多數(shù)學(xué)者認為CRP是區(qū)別細菌和病毒感染的有效指標，但CRP在肺炎支原體肺炎中的表達情況及作用機制目前眾說不一。

本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫法、免疫組織化學(xué)和RT－PCR方法從蛋白質(zhì)及核酸水平上研究了CRP在小鼠肺炎支原體肺炎模型中的表達情況，探討CRP在肺炎支原體肺炎中的相關(guān)作用機制，以期為肺炎支原體肺炎的臨床診斷、肺外并發(fā)癥的提示及治療提供指導(dǎo)與依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 菌株、主要試劑

肺炎支原體FH型標準株購于上海寶米科生物科技有限公司，PPLO培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司，ELISA試劑盒購于上海藍基生物公司，SP免疫組化試劑盒（KIT－9710）購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1．2 實驗動物

清潔級BALB／c小鼠，8－9周齡，體重20－25g，購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，均為雌性，共24只。按數(shù)字隨機表法分為A－C共3組，每組8只。其中A、B組為實驗組，C組為對照組。各組動物分籠飼養(yǎng)，實驗組和對照組分房飼養(yǎng)，自由取食飲水，動物房保持恒溫、恒濕，定期進行空氣消毒。

1．3 MP標準株培養(yǎng)及MP菌數(shù)的測定（CCU實驗） 見參考文獻1。

1．4 感染MP及臨床治療

先將動物用乙醚吸入麻醉，然后用加樣器吸取相應(yīng)體積的MP菌液或生理鹽水緩慢滴入小鼠的鼻腔。A、B組動物第0天接種含1×10－7ccu／ml的MP液各50μl；第5、8、9天接種含1×10－7ccu／ml的MP菌液各100μl。對照組以等量的培養(yǎng)基滴鼻接種。接種后每日觀察各組動物的采食、飲水、活動度等情況變化。

A組動物于第11天起至第15天每天分別給予阿奇霉素10mg／Kg，皮下注射。

1．5 標本的采集

B、C組實驗動物在11d處死，A組實驗動物在20天處死。小鼠摘除眼球取血，無菌條件下取肺臟稱重并取右中肺葉留作病原學(xué)檢測，余肺及心臟、腎臟、脾臟、肝臟分成兩份，一份用4%中性福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，5μm連續(xù)切片后制成切片HE染色觀察、進行組織病理學(xué)評分及免疫組化染色，另一部分保存于－80℃冰箱中，用于組織勻漿后提取組織總RNA進行RT－PCR檢測目的基因CRP mRNA的表達水平。

1．6 小鼠肺組織病理學(xué)評分系統(tǒng)

每只小鼠的肺組織均被檢測并計分，總分為0－26分。每張切片由5個分類評價系統(tǒng)組成，計算公式為：A分＋3（B分＋C分）＋D分＋E分［2］。

1．7 MP的病原學(xué)檢測

［1］。

1．8 應(yīng)用ELISA、免疫組織化學(xué)染色（S－P法）、RTPCR法測CRP的表達

嚴格按照說明書操作。

2 結(jié)果

2．1 小鼠肺炎支原體模型的建立及鑒定

2．1．1 成功培養(yǎng)肺炎支原體標準株，CCU值為10－7。

2．1．2 MP感染及治療后小鼠的一般情況 小鼠接種后全部存活，C組小鼠進食、飲水、活動度等正常，狀態(tài)良好。A、B兩組小鼠在第1天精神狀態(tài)略差，活動度降低，進食及排便減少，無咳嗽等呼吸系統(tǒng)癥狀，在第3天精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，鼻部出現(xiàn)少許分泌物，第6天，精神狀態(tài)差，活動度降低，進食減少，大便略稀，鼻腔分泌物同前，但出現(xiàn)咳嗽、豎毛、寒戰(zhàn)等癥狀，在第8、9天接種時乙醚麻醉后口鼻分泌物明顯增加，進食與活動度明顯低于對照組動物。經(jīng)阿奇霉素治療后小鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，咳嗽等癥狀逐漸減輕、消失。進食、活動度逐漸恢復(fù)。

2．1．3 MP的病原學(xué)檢測結(jié)果 A、B實驗組肺組織勻漿培養(yǎng)管中液體MP檢出率為100%，C對照組試管中液體排除MP的生長。經(jīng)細胞壁染色后，各組標本的MP培養(yǎng)產(chǎn)物于光鏡下觀察均未見有明顯細胞壁的雜菌存在。

2．1．4 小鼠肺組織及其他臟器病理學(xué)變化 ?HE染色顯示對照組的肺組織結(jié)構(gòu)正常（見圖1）。模型組肺組織多呈中度或重度炎癥改變（見圖2），其中有兩只小鼠肝臟呈輕度炎癥改變（見圖4），兩只腎臟呈輕度炎癥改變（見圖5）。治療組肺組織呈輕度炎癥或無炎癥（見圖3），兩只小鼠肝臟呈輕度炎癥改變（見圖6）。各組中心肌無明顯炎癥反應(yīng)。?肺組織病理學(xué)評分 對照組（C組）評分為0－1分，模型組評分為5．2－17分，平均9．8分，治療組評分為0－4．6，平均分2．8分。

2．2 ELISA檢測CRP結(jié)果

表1 CRP檢測結(jié)果（ng／mL，_x±s，n＝8）

2．3 免疫組織化學(xué)染色（SP法）結(jié)果

本研究選取8例正常小鼠、8例肺炎支原體模型、8例肺炎支原體模型治療組的肺組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)進行染色。CRP在正常組、模型組及治療組中的表達見表2。

2．4 RT－PCR結(jié)果

2．4．1 CRP mRNA在正常對照組、模型組及治療組肺組織中的表達 8例正常對照組組織中1例擴增出CRP目的片段，陽性表達率均為12．5%（1／8）。8例模型組組織中，7例擴增出CRP目的基因條帶，陽性表達率為87．5%（7／8）。8例治療組組織中，3例擴增出CRP目的基因條帶，陽性表達率為37．5%（3／8）。CRP mRNA在正常對照組、治療組、模型組肺組織的表達強度（相對系數(shù)）分別為0．457±0．126、1．256±0．324、2．405±0．378，CRP mRNA在正常對照組及模型組組織中的表達差異有顯著性（P＜0．05），CRP mRNA在模型組及治療組中的表達差異也有顯著性（P＜0．05）。CRP mRNA的表達隨著病理學(xué)炎癥程度的增加而表達上調(diào)。

表2 CRP在正常肺組織、模型組肺組織及治療組肺組織中的表達

圖7 CRP mRNA在正常對照組、治療組及模型組肺組織中的表達

3 討論

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種原核細胞型微生物，是能獨立生活的最小、最簡單的病原微生物。人群普遍易感，以年長兒多見。肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是兒童常見的呼吸道疾病，近年來，支原體肺炎發(fā)病率逐年增加。除引起呼吸道疾病外，MP還可引起心肌炎、腎炎、腦炎等許多呼吸系統(tǒng)以外的疾病，因而其早期診斷和治療非常重要。

CRP屬于急性時相反應(yīng)蛋白，是在感染性疾病的早期機體受微生物入侵或組織損傷等炎性刺激時由肝臟合成的一種異常蛋白，在人體內(nèi)廣泛分布，CRP作為鑒別細菌性感染和非細菌性感染的經(jīng)典試驗，早已廣泛應(yīng)用，但CRP在肺炎支原體肺炎中的表達情況及能否作為肺炎支原體肺炎的診斷依據(jù)，目前眾說不一，有文獻報道在支原體感染時ELISA法測CRP及hs－CRP值顯著升高，達77%及84．21%［3，4］，提示檢測CRP可能對小兒支原體肺炎的診斷有重要的臨床價值；也有研究提示在支原體感染患兒血中CRP升高者僅占37．5%、27%及32．58%，因此CRP不能作為支原體感染的一個敏感指標［5－7］。

本研究成功建立BALB／c小鼠的急性MP感染模型，并證實小劑量、間隔式的反復(fù)接種更適于小鼠MP感染的造模［1］，為進一步研究MP感染的發(fā)病機制和MP感染后機體免疫狀態(tài)奠定了實驗基礎(chǔ)。

CRP在肺炎支原體肺炎中的表達高于在正常肺組織、治療后的肺組織中的表達，其陽性表達強度與肺炎支原體肺炎的炎癥程度有關(guān)，隨病變程度的加重而增加。CRP在有肺外炎癥的陽性表達強度明顯高于無肺外炎癥組織中的表達，如CRP增高明顯或經(jīng)合理治療后降低緩慢應(yīng)注意肺外病變的可能。CRP在心肌細胞中無明顯陽性表達，可能與心肌損害較輕微、呈一過性，未引起明顯病理改變有關(guān)。

CRP的產(chǎn)生主要受IL－1、IL－6、TNF－α的調(diào)節(jié)，三者在參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面起著重要的作用。許多研究還提示CRP具有誘導(dǎo)效應(yīng)細胞產(chǎn)生炎癥因子的作用，Wang等發(fā)現(xiàn)用CRP刺激人血管內(nèi)皮細胞能夠明顯誘導(dǎo)受刺激內(nèi)皮細胞TNF－α的表達。炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生CRP，CRP的升高又促進炎癥因子TNF－α的產(chǎn)生，加重機體的損害。

綜上CRP可能參與了肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展過程，為其診斷、肺外炎癥的提示及合理治療提供依據(jù)。故臨床檢測CRP的動態(tài)變化對判斷病情嚴重程度、治療效果及預(yù)后有重要意義。

參考文獻：

［1］楊 春．探討接種時間和劑量對小鼠肺炎支原體肺炎模型建立的影響［J］．四川動物2009，28（4）：524．

［2］Martin RJ，Chu HW，Honour JM．Airway inflammation andbronchial hyperresponsiveness after mycoplasma pneumoniae infction in a murine model［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24：577．

［3］董 琳，溫懷凱，李昌崇．支原體肺炎血清急相蛋白水平變化及臨床價值［J］．中國當代兒科雜志，2001，3（5）：54．

［4］程學(xué)文．超敏C反應(yīng)蛋白檢測在小兒支原體肺炎中的價值 ［J］．河北醫(yī)藥，2010，32（20）：2856．

［5］吳謹準，吳夏萍．白細胞分類．C反應(yīng)蛋白在小兒肺炎支原體感染診斷中的意義探討［J］．福建醫(yī)藥雜志，2007，29（5）：131．

［6］林志芳，賈 冰．白細胞和超敏C反應(yīng)蛋白測定在小兒支原體肺炎中的臨床意義［J］．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（14）：849．

［7］李玉鳳，莫潤旺．C反應(yīng)蛋白在小兒支原體肺炎中的測定及臨床意義［J］．中國婦幼保健，2007，22（11）：1509．

The study on the expression and mechanisms of CRP in mouse model of mycoplasma pneumoniae pneumonia

HU Qi－bo，XU Zhong，GAO Hang，et al．（
The Pediatrics Department of the Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

Objective To research CRP expression in MPP，evaluate there clinical significance and mechanism．Methods A mouse model of mycoplasma pneumonia pneumonia，control group，model group，treatment group each consisting of eight mice were established．Saving blood serum、lungs and other visceral organ，We detected the expression of CRP in control group，model group and treatment group by ELISA，immunohistochemistry and RT－PCR．Statistical treatment was carried out with SPSSll．5software package．Results CRP have a high expression in lung tissue of model group which is significantly different with the expression in control group and treatment group（P＜0．05）．CRP have an apparent higher positive expression in the mice that has extrapulmonary complication than doesn’t has it（P＜0．05）．With the detection of ELISA and immunohistochemistry CRP provided positive results．And it was highly consistent with RT－PCR．Conclusion CRP have a significantly higher expression in model group lung tissue than in control group and treatment group．Its expression intensity is related to the severity of MPP．CRP have significantly high expressions in the mice with extrapulmonary complication than those without．CRP might be involved in the development and progression of MPP．Provide theory and experiment basis for MPP clinical diagnosis，prompting extrapulmonary complication and treatment．

CRP；MPP；mechanism；mice

R563．1＋5

A

2013－01－20）

1007－4287（2014）02－0183－04

＊通訊作者