多發性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表達變化

譚納宇，楊 樂，王瑩瑩，萬 超，于澤洋，何金婷＊，徐忠信＊

多發性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表達變化

譚納宇1，楊 樂2，王瑩瑩1，萬 超1，于澤洋1，何金婷1＊，徐忠信1＊

（1．吉林大學中日聯誼醫院神經內科，吉林長春130033；2．吉林省人民醫院內分泌科，吉林長春130021）

目的 探討CD4和CD28在多發性硬化患者中的表達變化。方法 采用流式細胞術檢測29例多發性硬化患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋的表達變化，采用EDSS量表對MS患者進行神經功能損傷評分。結果 復發期MS患者CD4＋表達明顯高于緩解期MS和對照組，緩解期MS患者外周CD4＋細胞明顯表達高于對照組；復發期MS患者CD28＋表達明顯低于緩解期，緩解期明顯低于對照組；CD4＋CD28＋三組比較無統計學差異；重度MS患者外周血CD4＋表達高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表達低于中度，而CD4＋CD28＋表達二組比較無統計學差異。結論 多發性硬化患者CD4＋表達水平升高，CD28＋表達水平降低，CD28＋可能促進CD4＋T淋巴細胞活化。

多發性硬化T細胞CD4CD28

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0210）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是臨床較常見的中樞神經系統自身免疫性疾病，但其確切發病機制尚未完全明確。研究表明CD4、CD8T淋巴細胞、小膠質細胞和巨噬細胞均參與 MS炎性反應［1］，大量研究提出了體液免疫、病毒感染、遺傳傾向、環境因素及個體易感因素綜合作用的多因素病因學說。近年研究發現，血液中CD4＋T細胞亞群的大量誘導及其對病灶部位的主動入侵，均能加速誘發組織損傷，CD28是激發T細胞反應的重要分子。本研究對MS患者CD4T淋巴細胞及CD28的表達進行檢測，同時采用EDSS量表對MS患者進行功能評分，觀察MS患者CD4、CD28表達與MS患者病情復發緩解的關系，以期對MS患者病情嚴重程度監測起到一定的指導意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料

全部病例來自吉林大學中日聯誼醫院神經內科患者。MS患者均符合Poser診斷標準［2］，所有患者均為臨床確診的復發緩解型MS，共計29例，其中男6例，女23例，年齡18－61歲，平均36．6± 10．5，病程5個月至11年，復發次數1－7次。

1．2 研究對象及分組

所有MS患者及對照組均無其他自身免疫病、組織損傷、腫瘤、遺傳變性疾病，其中MS復發組：19例，MS緩解組：10例，對照組：18例為同期健康體檢者。以上各組間性別及年齡分布無顯著差異性。

1．3 EDSS功能評分

多發性硬化傷殘功能采用EDSS評分（Kurtzke標準）［3］。據MS患者病損程度分類，中度（1－5分）13例，重度（5分以上）16例。

1．4 CD4＋、CD28＋及CD4＋CD28＋檢測

單克隆抗體分別為CD4－PE為藻紅蛋白熒光素標記和CD28－FITC為異硫氰熒光素標記，夠自法國Immunotech公司，檢測方法為流式細胞術（美國Beckman－Coulter ELITE型流式細胞儀）

血液樣本用EDTA抗凝管抽取，收集靜脈血3 ml，在測定管中加入全血100μl，避光30min、溶血10min裂解紅細胞、然后加入不同熒光素標記的anti－CD4，CD28的抗體，室溫下混勻，離心（1 000 rpm，10min）、PBS 1．0ml（0．1MpH7．4）洗滌、離心（1 500rpm，5min）、棄上清、加0．6ml PBS（0．1MPH7．4），上機檢測分析。

1．5 統計學方法

采用SPSS16．0軟件包處理，計量資料以_x±s表示，多組之間均數比較采用t檢驗。

2 結果

2．1 患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達變化

復發期、緩解期、對照組CD4＋表達水平分別為50．62±8．42、37．91±7．45、30．68±7．29，CD8＋表達水平分別為42．22±6．29、49．38±7．52、54．79± 7．43，CD4＋CD28＋，20．34±5．63、22．46±5．87、23．15±6．59。結果表明，復發期MS患者CD4＋表達水平高于緩解期MS患者和對照組，有統計學差異（P＜0．05），緩解期CD4＋表達水平高于對照組。復發期CD28＋表達水平低于緩解期MS和對照組（P＜0．05），緩解期CD28＋表達水平亦低于對照組（P＜0．05），三組CD4＋CD28＋表達水平無統計學差異（P＞0．05），見圖1。

圖1 MS患者外周血CD4＋、CD28、CD4＋CD28＋表達變化（%）

2．2 不同病情嚴重程度患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達變化

外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達，EDSS中度分別為47．67±6．42 49．27±8．32 22．13 ±5．87，EDSS重度度分別為54．54±6．79、42．76± 7．64、24．24±6．56。結果表明，重度患者CD4＋表達水平高于中度（P＜0．05），重度患者CD28＋表達水平低于中度（P＜0．05），二組CD4＋CD28＋表達水平比較無統計學差異（P＞0．05），見圖2。

圖2 不同病損程度MS患者CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達變化（%）

2．3 患者CD4＋和CD28＋表達相關性分析

相關分析顯示，多發性硬化患者CD4＋表達水平與CD28＋表達水平具有正相關性，r＝0．77（P＜0．01）。

3 討論

多發性硬化（MS）是以中樞神經系統白質脫髓鞘病變為特點，遺傳易感個體與環境因素作用發生的自身免疫性疾病。研究發現，患有多發性硬化癥的患者腦和脊髓中出現持久的組織損傷可能是由于誤導的殺傷性T細胞失去控制所致。MS是以神經纖維髓鞘損傷和軸突破壞、電脈沖傳導性減弱、分散投射為特點的炎性病變［4］。MS被認為是人體的正常防御病原體機制的崩塌因而出現自我攻擊，由于T細胞識別來源于病原體，髓鞘或其它來源的的蛋白質，需要其他細胞將目標蛋白質分解成稱為肽的小片段，然后在特定的分子包將肽段遞呈給T細胞［5］，并已確定參與MS的病理過程中遞呈髓鞘蛋白的T細胞即CD4＋T細胞在MS的髓鞘損傷中發揮了重要的作用，在人類MS在動物模型的實驗性自身免疫性腦炎中，CD4＋T細胞在炎癥反應中占有顯著的比例。在T淋巴細胞的激活過程中，如沒有共刺激信號存在，T細胞呈無反應或免疫耐受，若共刺激信號表達狀態異常，可發生自身反應性T細胞激活或自身免疫反應［6］。CD28分子是迄今為止所發現的能促使T細胞活化最重要的共刺激分子，屬于免疫球蛋白超家族成員，表達于靜止的CD4＋和CD8＋T細胞，與其配體結合后對免疫應答的啟動、維持和下調中都起著非常重要的作用［7］。

本研究應用流式細胞術檢測28例MS患者T淋巴細胞表面分子CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋，結果顯示，復發期MS患者CD4＋表達水平高于緩解期MS和對照組，緩解期CD4＋表達水平高于對照組，CD28＋表達水平復發期低于緩解期，緩解期低于對照組。EDSS是臨床應用最普遍的多發性硬化的評估量表，也是臨床試驗中廣泛采用的評價指標。EDSS評分以中樞神經系統八個功能系統的評價為基礎，分級從正常（0分）到最嚴重缺損（5－6分）變化，此外，還有行動能力和日常生活限制的評定。本研究應用EDSS量表對MS患者進行傷殘評分，按評分將MS患者分為中、重度，對不同病損程度MS患者外周血CD4＋及CD28＋表達水平進行了比較分析，結果顯示，重度MS患者外周血CD4＋表達高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表達低于中度，相關分析顯示，CD4＋、CD28＋的表達可能與多發性硬化病情的嚴重程度有關。

目前關于多發性硬化治療的目的是控制疾病的嚴重程度或減少復發次數以延緩神經功能損傷的進展，本研究探討CD4＋和CD28＋等免疫細胞在MS中的作用，期待發現可能防止或控制疾病的治療靶標或找到利用人體自身的保護機制的途徑，這可能會產生具有高度特異性的治療方法，可避免廣泛的免疫抑制如糖皮質激素或氨甲喋呤等產生的副作用。

［1］Zhang X，Tao Y，Ahn M，Marcus KL，Differential Reconstitution of T Cell Subsets following Immunodepleting Treatment with Alemtuzumab（Anti－CD52Monoclonal Antibody）in Patients with Relapsing－Remitting Multiple Sclerosis［J］．J Immunol 2013，191（12）：5867．

［2］Cerosaletti K，Schneider A，Schwedhelm K，Multiple Autoimmune－Associated Variants Confer Decreased IL－2RSignaling in CD4（＋）CD25TCells of Type 1Diabetic and Multiple Sclerosis Patients．［J］．PLos One，2013，8（12）：83811．

［3］Trinschek B，Lussi F，Haas J，Wildemann B，Kinetics of IL－6production defines T effector cell responsiveness to regulatory T cells in multiple sclerosis［J］．PLos One 2013 14；8（10）：7634．

［4］Buntinx M，Ameloot M，Steels P，et al．Interferon－gamma－induced calcium influx in T lymphocytes of multiple sclerosis and rheumatoid arthritis patients：a complementary mechanismcelactivation［J］．Neuroimmunol，2005，124（1，2）：70．

［5］Leary SM，Thompson AJ，primary progressive mutiple scerosis：cur－－rent and future treatment options．CNS Drugs［J］．2005，19（5）：369．

［6］CamperioC，Muscolini M，Volpe E，Di Mitri D，CD28ligation in the absence of TCR stimulation up－regulates IL－17Aand pro－inflammatory cytokines in relapsing－remitting multiple sclerosis T lymphocytes［J］．Immunol letter．2014，78（14）：2．

［7］Killestein J，Polman CH．Current trials in mutiple sclerosis：established evidence and future hopes［J］．Curropin Neurol，2005，18（3）：253．

Expression of CD4 and CD28 costimulatory molecules of Multiple sclerosis

TAN Na－yu，YANG Le，WANG Ying－ying，et al．
（Department of Neurology，China－Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin130033，China）

Objective To investigate the expression of multiple sclerosis patients with CD4Tlymphocytes and CD28 costimulatory molecules．Methods Flow cytometry was used in 28patients with MS peripheral blood T lymphocytes CD4＋，CD28＋，CD4＋CD28＋were detected，and the application for MS patients with EDSS disability scale score．Results Relapse of MS patients with CD4＋remission of MS was higher than the control group，remission MS patients with peripheral CD4＋cells expressed higher；relapsed CD28＋peripheral blood of MS patients was lower than in remission，remission than the control group；CD4＋CD28＋three groups showed no significant differences；severe MS patients was higher than in peripheral blood CD4＋moderate，severe peripheral blood CD28＋MS patients was lower than moderate，and CD4＋CD28＋expression of the two groups showed no significant difference．Conclusion Patients with multiple sclerosis accompanied by increased expression of CD4＋with CD28＋expression of costimulatory molecules reduced costimulatory molecules CD28＋lymphocytes in abnormal activation plays an important role，CD28expression abnormalities may also be involved in its pathogenesis．

Multiple sclerosis；T lymphocytes；CD4；CD28

R744．5＋1

A

譚納宇，女，在讀碩士，主要從事臨床神經病學。

2013－02－28）

1007－4287（2014）02－0210－03

＊通訊作者